[发明专利]一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及固氮菌固氮酶活性的测定方法，具体是测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法。

背景技术

固氮酶活性测定是鉴别固氮微生物固氮能力或固氮效能大小的指标。甘蔗生物固氮能力测定常用的有乙炔还原法、氮平衡法、¹⁵N同位素稀释法、¹⁵N同位素自然丰度法等。其中乙炔还原法测定固氮酶活性为常用的方法，它具有灵敏度高、且方法简单、速度快等特点。其反应式如下：

从理论上计算，还原3克分子乙炔即相当于还原1克分子氮，理论换算比值为3∶1。

甘蔗生物固氮为联合固氮，植株高大，进入伸长期其固氮能力才能充分表现，因此测定甘蔗固氮酶活性时一般都用器官的某一部分，同时在测定样品中加入一定数量的液体培养基，常用的培养基有SNX培养基(韦莉萍，李杨瑞，杨丽涛.钼对甘蔗体内固氮菌的固氮酶活性的影响[J]，植物营养与肥料学报，2007，01)、JNFb培养基(桂意云，刘昔辉，杨荣仲，李杨瑞.甘蔗不同部位的固氮酶活性检测[J]，植物生理学通讯，2007，02)和LGI-P培养基(R.Muthukumarasamy；G.RevathiC.Lakshmi naras imhan.Influence of Nfertilisation on the isolation of Acetobacter diazotrophicus andHerbaspirillum spp.from Indian sugarcane varieties[J].Biol FertilSoils.1999.29:157-164)

用这几种培养基测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性有以下不足处：

对于SNX培养基有：1)因培养基未进行高压处理，测试样品操作过程中未进行有效防菌处理，因此同一样品不同重复间存在较大的差异，2)培养基的组成成分较为适宜碱性固氮菌生存，因此测定结果为适宜在SNX培养基生存固氮菌的固氮酶活性。

对于JNFb培养基有：1)培养基的组成成分较为复杂，培养基的配制较为复杂；2)与SNX培养基相似，它对固氮菌的生存仍然有较强的选择性，适宜碱性固氮菌生存；因此结果仍为甘蔗体内适宜JNFb培养基的固氮菌的固氮酶活性。

对于LGI-P培养基有：培养基组成复杂，对甘蔗体内固氮菌有选择作用，固氮适宜酸性固氮菌生存。

因此用这几种培养基测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性，获得的结果均为适应相应培养基固氮菌的固氮酶活性，而已有的研究及相关文献报道表明，目前已用多种不同培养基从甘蔗分离到了10多种固氮菌(苏俊波；杨荣仲；桂意云；李杨瑞；雷新涛；张海林。甘蔗体内具有固氮酶活性细菌的分离、鉴定及其相关特性研究[J]，西南农业学报，2007，5)，因此固氮酶活测定结果不能准确反应甘蔗体内固氮菌的固氮酶活性状况。

发明内容

本发明为了克服现有技术的不足，提供一种培养基配方组成简单易于配制，易于反应不同品种间固氮菌固氮酶活性差异，且培养基的选择性小，有利甘蔗体内多种固氮菌生长繁殖的甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的测定方法。为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种测定甘蔗体内固氮菌固氮酶活性的方法，步骤依次如下：

(一)SH培养基组成与配制

用蒸馏水和蔗糖配制成含蔗糖10％、pH为5.8的培养基，简称SH培养基。将其分装后，在121℃高温15min备用。同时高温测定酶活性所需的无菌水、纸及酶活性操作过程中的相关工具等。

(二)取样与样品处理：

取+5至+7叶的蔗茎带回室内，自来水冲洗，蒸馏水冲洗，无菌水冲洗、无菌纸除水，用高压消毒的刀具去蔗皮，取+6叶蔗茎中部切碎(要求细小均匀)，称取样品2g，转入60ml培养瓶中，加培养基至总体积为10ml，用胶塞密封好。

(三)温育

将密封好的培养瓶转入温度为28℃，转速为60—70转/分钟的摇床中，培养一天(如为第3、4、5、6天测定，则为分别培养2、3、4、5天)后用注射器注入浓度为100％乙炔气0.5ml，继续放入摇床温育一天，温育结束后加入50％三氯乙酸250ul中止固氮酶活性。

(四)标准曲线制作