[发明专利]过滤式微量核酸临床样品快速处理方法

说明书

技术领域

本发明涉及各种核酸生物样品的快速处理方法。更具体地，本发明涉及采用 过滤方式快速处理和提取临床生物样品中微量核酸样品的方法，包括临床生物样 品中细胞富集和裂解细胞提取核酸。

本发明还涉及用于快速处理微量核酸临床样品的试剂盒及其应用。

背景技术

临床常常需要从各种生物组织或细胞中抽提基因组DNA，应用核酸扩增技术测 定其成分，这是用于病症的辅助性分析和诊断的一种高度敏感，且最为直接的检 测手段。由于临床标本中含有蛋白质、脂类等物质，会干扰其下游扩增反应，故 在进行检测反应前必须进行生物样品的处理和核酸提取。由于样本的处理及保存 对DNA和RNA(尤其是RNA)的影响较大，因此在核酸标本的适当的预处理及保存 对核酸模板的成功提取具有决定性作用。临床常见的标本有血清(浆)、全血、 分泌物、棉拭子、脓液、体液等，这些临床标本的处理和保存方法各有不同。以 下是不同临床标本的处理方法及步骤：

1.痰标本

痰属于分泌物，临床上常用作结核杆菌DNA测定样本，由于痰标本中含大量 粘蛋白和杂质，故在核酸提取时，一定要对标本进行前处理，即用液化液去除粘 蛋白，然后用煮沸或蛋白酶、酚/氯仿等经典法提取DNA。

2.棉拭子

用核酸扩增方法检测性病病原体时(衣原体、支原体、淋球菌、梅毒螺旋 体、单纯性疱疹病毒、人乳头状瘤病毒等)，临床标本一般为棉拭子。现在应用 的处理棉拭子具体方法为，用棉拭子取分泌物，置无菌试管或EP管内，在样品管 中加无菌生理盐水，充分震荡混匀后离心，弃上清，沉淀加无菌生理盐水1ml，打 匀的离心，重复洗涤一次，弃上清，沉淀即可用于DNA提取。

3.体液

体液标本，包括胸水、腹水、脑脊液、尿液等，可直接离心5分钟，取沉淀 物提取核酸。

血性胸腹水，可加等体积红细胞裂解液，震荡混匀后离心，可根据情况重复 2-3次，沉淀物用于DNA提取。

4.脓液

粘稠脓液：同痰标本处理，先将其液化，再离心取沉淀提取DNA。

水样脓液：直接离心，沉淀用生理盐水洗2-3次后用于DNA提取。

5.血清(浆)标本

一些病原体，如乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒 (HIV)等的核酸扩增检测常采用血清或血浆标本。如HBV标本为血浆标本时一般 用EDTA-Na2或枸橼酸纳作抗凝剂。标本为全血时，及时分离出血浆，提取病毒 DNA进行检测。对于HCV，则检测RNA病毒。由于RNA极易降解，标本的制备和保 存方式往往可以影响测定结果。若用血浆标本，应使用EDTA抗凝。抗凝后6小时 内分离血浆。如用血清标本，则应尽快(2小时内)分离血清进行检测，或需在- 20℃保存。

6.全血标本

通常用来提取外周血单个核细胞核酸：如基因组DNA、线粒体DNA、总RNA 等。需要采用前处理，即加适量的红细胞裂解液(破膜液)，裂解全血中的红细 胞；随后再加适量的细胞核裂液(破核液)，裂解白细胞中的细胞核，使核内DNA 释放出来；最后再加SDS(十二烷基硫酸钠)等去污剂，溶解脂蛋白，解聚核蛋 白。

(二).核酸提取

核酸提取已经成为了分子生物学实验技术中的最重要、最基本的操作，但是 目前核酸的提取方案纷繁浩渺。分子诊断市场的发展和测序市场、功能基因组计 划的启动已经为核酸提取市场加足了油，传统的操作流程已经被更为简便和自动 化的化学溶液代替，现在前市场上大部分核酸提取系统包括一个固体的纯化支持 物，如离心柱里的薄膜，或者磁珠。有一些则设计成方便使用的微孔板的形式。

核酸在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，在核酸提取过程中应根据不 同研究需要，保证核酸结构的相应完整性；尽量排除其它大分子成分(蛋白质、多 糖等)的污染；和保证提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属 离子。表1是对几种DNA提取方法比较：

表1：各种DNA提取方法比较