[发明专利]检测和纯化对HLA体系中存在的肽特异的CD8+T淋巴细胞群的方法

说明书

本申请是申请日2000年9月5日、发明名称为“检测和纯化对HLA 体系中存在的肽特异的CD8+T淋巴细胞群的方法”的PCT申请的分案申 请。

本发明涉及检测和纯化对HLA体系中存在的肽特异的TCD8+淋巴细 胞群的方法。

T淋巴细胞带有其所针对抗原的特异性受体，称为TCR。TCR由多条 链组成，其中α和β链参与对存在于HLA分子中的特定抗原性肽的特异 性识别。这种识别体现在T淋巴细胞α/β TCR以一定亲和性与存在于 靶细胞表面的HLA-肽复合物结合的能力。反过来，可溶性HLA-肽复合物 能够与存在于对所述HLA-肽复合物特异的T淋巴细胞表面的TCR结合。

迄今，在分子水平上研究最彻底的系统是CD8+T淋巴细胞对存在于 I型主要组织相容性复合物的分子中、尤其是所谓HLA-A0201中的抗原 性肽的识别。

在该系统中，已确认TCR对HLA-肽的亲和力比抗体对其抗原的亲和 力小得多。因此，利用装载有肽并标记的可溶性HLA-A0201分子检测携 带对HLA体系中特定肽反应活性之TCR的淋巴细胞是不可能的。为了克 服这种低亲和性，Altman等(1)已制备了一种由HLA重链生物素化的 HLA-A0201-肽复合物组成的多价反应物，它能与链霉抗生物素结合成四 聚体。该HLA-肽四聚体对带有适当TCR的T淋巴细胞具有高亲和力，从 而可用于通过免疫荧光法显现反应活性细胞群。

但TCR不是T淋巴细胞中能与HLA-肽复合物相作用的唯一分子。 实际上，在生理识别的情形中，TCR与MHC-肽复合物的结合因CD8共 同受体与I型MHC分子的恒定部分的结合而增强。CD8在该相互作用 中的参与因不同的淋巴细胞克隆而不同，在某些情况下可能导致与给 定HLA-肽复合物结合能力的大幅提高。CD8这种与I类HLA结合的能 力结果导致I类HLA四聚体与带有HLA-肽非特异性TCR的CD8+T淋 巴细胞结合的背景噪音。这种背景噪音随着所用四聚体的浓度而增 加，并可能导致免疫荧光的假阳性。为试图减小这种非特异性标记， 大部分研究组在抗CD8抗体的存在下用I类HLA四聚体进行标记。但 只有某些抗CD8抗体有效，而且抗体与四聚体之间的最佳浓度必需在 每次试验时重新调节。由于这些缺点，检测存在于一种非特异性细胞 群中的低含量的特异性亚细胞群(如约0.1-1％)变得很困难。

另外，已提出了HLA四聚体的另一潜在应用。即通过分选(流式细 胞仪或通过免疫磁分选)分离在体外扩增结束时与给定HLA-肽反应的 淋巴细胞群，然后在抗病毒或抗肿瘤的被动免疫程序中发挥治疗应 用。但出于CD8参与的四聚体结合的背景噪音可能对这一应用构成严 重的障碍，因为它另致分离出常常相当大一部分对选择的HLA-肽复合 物不反应的T淋巴细胞。

Salter等(2)显示，当HLA在α3结构域中带有一突变时，具有 CD8 αα共同受体的转染细胞所表达膜HLA的结合将改变。

本发明人的研究证实，可溶性突变四聚体结合CD8的效力降低， 无论该CD8是αα或αβ及是否与T淋巴细胞表面的TCR结合，这表 现为背景噪音降低。

由此人们会预计，突变引起的亲和力损失将导致对某些CD8依赖 性T淋巴细胞克隆特异性信号的全部或部分损失。关于这一点，Salter 等的文章表明，一些CD8依赖性同种异体反应性克隆对突变HLA-A2 携带细胞丧失其细胞毒性而对其它的少有影响。

因此这些突变四聚体可能只检测到一个多克隆细胞群中的一部分 反应性细胞(CD8依赖性小的)。

但在本发明人用抗CD8抗体进行双标记试验中，用突变和天然四 聚体对多克隆细胞群的比较标记数出人意料地表明，突变的四聚体与 天然四聚体识别相同百分比的特异性细胞。

另外，突变四聚体对CD8依赖性高的克隆和CD8依赖性低的克隆 的标记比较表明，用TCR表达强度报告的四聚体的结合效力相当。

因此看来突变很大程度上降低了四聚体与CD8本身的结合，但对 其与TCR-CD8复合物的结合的影响很小。

本发明基于利用在突变(更一般地讲为改变)的HLA多聚体中证明 的特性，涉及作为新产品的如多聚体和其与抗原性肽的复合物。

本发明还涉及这些分子检测和/或分离肽特异性CD8+T淋巴细胞 群的应用。