[发明专利]在活性位点环区中具有额外氨基酸残基的I－S1和I－S2亚组枯草杆菌酶

说明书

本案为申请日1999年12月20日，优先权日1998年12月18日，发明名称为“活性位点环区中具有额外氨基酸残基的I-S1和I-S2亚组枯草杆菌酶”的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种新的I-S1和I-S2亚组的枯草杆菌酶(subtilase)，其在从95-103位的活性位点环(b)区中的103位具有至少一个额外的氨基酸残基。这些蛋白酶当用于洗涤剂、清洁和洗涤剂组合物时，显示出色的或改良的洗涤性能。本发明还涉及编码用于所述酶表达的基因，当所述基因插入适当的宿主细胞或生物时表达所述酶。本发明还涉及用所述基因转化的且能够表达所述酶变体的宿主细胞，以及制备新型酶的方法

发明背景

在洗涤剂工业中，酶在洗涤配方中的应用已经超过30年。用于这些制剂的酶包括：蛋白酶、脂酶、淀粉酶、纤维素酶以及其它酶，或者它们的混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。

越来越多的商业上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程变体，如DURAZYM(Novo Nordisk A/S)、RELASE(Novo Nordisk A/S)、MAXAPEM(Gist-Brocades N.V.)、PURAFECT(Genencor国际有限公司)。

还有许多蛋白酶变体在本领域中已有描述，如EP 130756(GENENTECH)(相应于美国再颁专利34,606(GENENCOR))；EP214435(HENKEL)；WO 87/04461(AMGEN)；WO 87/05050(GENEX)；EP 260105(GENENCOR)；Thomas，Russell和Fersht(1985)自然(Nature)318 375-376；Thomas，Russell和Fersht(1987)分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)193 803-813；Russell和Fersht(1987)自然328496-500(1987)；WO 88/08028(Genex)；WO 88/08033(AMGEN)；WO95/27049(SOLVAY S.A.)；WO 95/30011(PROCTER & GAMBLE公司)；WO 95/30010(PROCTER & GAMBLE公司)；WO95/29979(PROCTER & GAMBLE公司)；US 5.543.302(SOLVAYS.A.)；EP 251 446(GENENCOR)；WO 89/06279(Novo Nordisk A/S)；WO 91/00345(Novo Nordisk A/S)；EP 525 610 A1(SOLVAY)和WO94/02618(GIST-BROCADES N.V.)。

然而，尽管已经描述了许多有用的蛋白酶变体，许多工业用途仍然需要新的改良的蛋白酶或蛋白酶变体。

因此，本发明的目的是提供改良的蛋白酶或蛋白质工程化蛋白酶变体，尤其是用于洗涤剂工业。

发明概述

本发明人发现了这样的枯草杆菌酶，其中至少一个活性位点环比那些已知的长，所述酶在洗涤剂组合物中显示改进的洗涤性能。在构建尤其是枯草蛋白酶309(BLSAVI或SAVINASE)的枯草蛋白酶(subtilisin)变体中对其进行了鉴定，相对于亲本野生型酶该酶显示出改进的洗涤特性。这一点在我们早先的申请DK1332/97中已描述。

已知I-S1(真“枯草蛋白酶”)或I-S2(高碱性枯草蛋白酶)亚组中的某些枯草杆菌酶或其变体在从95-103位的活性位点环(b)区中的103位(或在103位与104位之间)具有至少一个额外的氨基酸残基，与目前已知的那些和在所述申请中描述的那些相比，所述酶显示出人意料的改良的洗涤性能。

本发明改进的蛋白酶可通过从自然资源中分离获得，或通过在野生枯草杆菌酶的103与104位之间的活性位点环(b)中导入至少一个额外的氨基酸残基(一个插入)获得(对于活性位点环和位置编码见下述)。

尽管本发现是在枯草蛋白酶309，预计可能产生或分离类似有益的枯草杆菌酶或枯草杆菌酶变体。