[发明专利]一种分离单个核细胞的方法和装置

说明书

技术领域

本发明提供了一种分离单个核细胞的方法和装置，特别是一种分离脐带血、骨髓、外周血单个核细胞的装置

背景技术

脐带血、骨髓、外周血是造血干细胞的三大来源，造血干细胞移植已成为治疗多种血液病、某些恶性实体肿瘤、部分遗传性疾病、重症免疫缺陷等疾病的最有效措施之一。临床应用已证明造血干细胞移植对于重建或改善骨髓造血功能有良好疗效。单个核细胞(MNC)(包括单核细胞、淋巴细胞、干细胞等)是造血干细胞移植的有效成分，MNC的分离是干细胞移植和进一步研究的关键环节，它直接关系到分离后样本体积、造血干/祖细胞或间质干细胞分离率、细胞活性维持及移植的成败。

目前分离单个核细胞主要有以下几种方法：

(1)Ficoll-Hypaque(d＝1.077，商品名Ficoll液)分层法；即聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)分层法；

(2)3％明胶自然沉降法：

(3)6％羟乙基淀粉(HES)自然沉降法：

其中以Ficoll-Hypaque(d＝1.077)分层法最为经典和常用，其原理是常用来分层液比重是1.077±0.001g/mL的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin)(F/H)分层液，Ficoll是蔗糖的多聚体，呈中性，平均分子量为400,000，当密度为1.2g/ml仍未超出正常生理性渗透压，也不穿过生物膜。由于MNC与血液中的其它成分存在着密度差异，在作密度梯度离心时，各种血液成分将按照密度梯度重新分布聚集，血浆和血小板由于密度较低，悬浮于分离液层面的上方，红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；单个核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分层液中。吸取分层液液面的细胞，就可分离到单个核细胞。

但是目前国内外分离单个核细胞一般为试管法，试管法单次分离脐带血量小(最大量25ml)，分离脐带血量多的样本时，使用的离心管数量多，成本高，工作量大，效率低，重复的开放操作很容易造成微生物污染，不适宜大批量脐血的分离，多用于实验研究。分离外周血等其它样本时也存在类似问题。

目前已有研究者注意这个问题，并展开了一些研究。如申请号为CN200610114475.9的中国专利，提供了一种用于分离骨髓单个核细胞的试剂盒，包括稀释液、洗涤液，由分离液A和B组成的分离液，所述的稀释液为生理盐水、PBS或Hank’s液，洗涤液为生理盐水、PBS或Hank’s液，分离液A为质量/体积百分比浓度为5.5-6.5％的羟乙基淀粉或0.45-0.55％甲基纤维素溶液；分离液B为密度为1.077g/ml的Ficoll-Hypaque溶液或密度1.073g/ml的Percoll液。该试剂盒具有使用方便、成本低廉、分离效果好的有点。

但上述发明仍然未解决试管法单次分离量小以及多次重复操作带来的污染等问题，因此又有研究者提出用多联袋离心分离单个核细胞。

如《三联袋两次离心法分离脐血有核细胞研究》(临床血液学杂志1999年第1期第12卷)中提到使用三联袋两次离心法分离脐血有核细胞，脐血收集在400ml三联袋(上海血液中心)中，在10℃1800r/min倒置离心15min，弃去下层红细胞层于一转移袋中，然后正向离心3000r/min 15min，弃去部分血浆于另一转移袋中，使白细胞层的体积浓缩为40ml左右。

《多联袋无菌制备脐带血间质干细胞的方法及效果》(中国组织工程研究与临床康复，2007，11(24)：4781-4784)，使用无菌塑料四联袋(山东威高集团公司生产：1个主袋，2个空袋，1个生理盐水袋)，先将Ficoll-Hypaque混合溶液加入四联袋的主袋内，利用无菌接口机将盛有Ficoll-Hypaque混合溶液的四联袋与脐带血收集袋相连，再将样本血液沿袋壁缓慢加入四联袋主袋内液面上，保持血液和淋巴细胞分离液的界面清晰。将四联袋平衡后置入大型低温离心机内，1500r/min、22℃离心30min。离心后轻轻取出四联袋，将主袋放在分浆夹上，此时袋内的液体自上而下分为5层：血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层、多核细胞层、红细胞层。将血浆血小板层的上2/3液体挤压入四联袋的一空袋内，将剩余的血浆血小板层、单个核细胞层、淋巴细胞分离液层的上部，挤压入四联袋另一空袋内，即为富含单个核细胞的液体。

但是该方案仍然存在红细胞混入量高等问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种分离单个核细胞的方法。