[发明专利]碱性磷酸酶标记试剂盒、免疫测定试剂盒及免疫测定方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种碱性磷酸酶(ALP)标记检测用试剂盒。本发明还涉及一种免疫测定用试剂盒及用该免疫测定用试剂盒的免疫测定方法。

背景技术：

碱性磷酸酶(以下也称ALP)是一种在酶联免疫测定法中通常作为标记使用的酶。ALP在从高等动物到细菌几乎所有生物中都能看到，在高等动物中有内脏器官特异性异酶。血液等体液中已知含有来源于肝脏的ALP和来源于骨骼的ALP等内源性ALP。因此，以ALP为标记进行免疫测定时，不仅ALP标记，来源于标本的内源性ALP也与底物反应，从而难以获得正确的测定结果。

作为有助于抑制这种内源性ALP影响的物质，有针对内源性ALP的抑制剂(以下也称内源性ALP抑制剂)。以下列举使用内源性ALP抑制剂抑制内源性ALP影响的方法。

美国专利第5948630号作为减少内源性ALP影响的方法，介绍使用含人ALP抑制剂的漂洗成份。

EP公开公报第530490号上记述的方法是，把ALP标记到结合在CD4等细胞表面标记物的抗体，用此ALP标记抗体分类淋巴细胞的亚型。在此，使用了含底物的约pH9.5的缓冲剂/底物溶液和含左旋咪唑的pH7.4的细胞清洗液。

美国专利第5948630号在实施例中记述，使用含有作为底物的4-MUP和作为内源性ALP抑制剂的左旋咪唑的底物/清洗液。ALP的pH为碱性，故一般为了在合适的条件下让ALP标记与底物反应，含底物的试剂都被设定为碱性。在专利文献1中也记述了洗涤剂成份的合适pH范围约为7.0至10.0。然而，左旋咪唑等内源性ALP抑制剂在碱性条件下会变得不稳定。因此，有时专利文献1中记述的洗涤剂成份为了稳定内源性ALP抑制剂而不能使用。

根据EP公开公报第530490号上的记述，将用ALP标记抗体处理的细胞用细胞清洗液清洗二遍后，再加入缓冲剂/底物溶液测定ALP活性所引起的染色。一般来说，细胞清洗液在清洗后要从细胞除去，因此，ALP标记和底物反应的反应液中实际上不含细胞清洗液。因此，当清洗时未能充分抑制内源性ALP时，ALP标记和底物反应时就可能无法消除内源性ALP的影响。

发明内容：

本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。

本发明提供一种碱性磷酸酶标记检测用试剂盒，包括：可与靶向物质结合的碱性磷酸酶标记物，碱性磷酸酶相应的底物，含抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与所述靶向物质结合的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

所述靶向物质是含待测物质和经抗原抗体反应可与之结合的第一结合物的复合物中的待测物质。

所述的试剂盒可用于竞争法免疫测定，此时所述靶向物质指经抗原抗体反应可与待测物质结合的第一结合物。

所述碱性磷酸酶标记物含可与靶向物质结合的第二结合物和碱性磷酸酶。

所述的试剂盒含有所述辅助试剂液的碱性磷酸酶和底物的反应液为碱性。

所述底物液为碱性，所述辅助试剂液为中性或酸性。所述底物液和所述辅助试剂液含有缓冲剂，所述底物液有大于所述辅助试剂液的缓冲能。

所述抑制剂为左旋咪唑。

所述碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶为来源于细菌的碱性磷酸酶或来源于肠的碱性磷酸酶。

本发明还提供一种免疫测定用试剂盒，包括：经抗原抗体反应可与待测物质结合的第一结合物，固定含第一结合物和待测物质的复合物的固相，可与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物，含有碱性磷酸酶相应底物的底物液；及含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

本发明再提供一种使用竞争法的免疫测定用试剂盒，包括：碱性磷酸酶标记物，可通过抗体抗原反应与待测物质和碱性磷酸酶标记物结合的第一结合物，固定第一结合物的固相，含有碱性磷酸酶相应底物的底物液；及含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂、在与第一结合物结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶和底物反应时添加的辅助试剂液。

本发明另提供一种免疫测定的方法，包括：固定步骤，在固相上形成一种复合物，所述复合物含有标本中的待测物质、可与待测物质结合的碱性磷酸酶标记物、经抗原抗体反应可与待测物质结合的、并可与固相结合的第一结合物；反应步骤，让与复合物中待测物质结合的碱性磷酸酶标记物的碱性磷酸酶与底物液中所含碱性磷酸酶相应底物在含有抑制内源性碱性磷酸酶的抑制剂的辅助试剂液存在的情况下发生反应；及测定步骤，检测碱性磷酸酶与底物反应生成的产物。