[发明专利]细胞内病原微生物核酸定量提取和纯化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞内病原微生物核酸定量提取和纯化方法、细胞内病原微生物核酸定量提取纯化试剂盒，以及该试剂盒的用途。

背景技术

临床检测细胞内病原微生物(如HPV，HIV、衣原体等)感染时希望能得到定量的结果以便于对病情作出更准确的判断。但是由于标本定量采集在大多数情况下难以实现，因此无法进行定量的细胞内病原微生物的检测。在临床实践中，实时荧光定量聚合酶链式反应方法(quantitative real-time polymerase chain reaction)是一个广泛应用的定量的高灵敏度、高特异性的方法。该方法是通过特异地体外扩增被检测病原微生物核酸的方法来检测样品中是否存在某种特定的病原微生物。在进行PCR之前通常要对样品进行处理。样本的前处理方法对病原微生物核酸检测的成功与否至关重要。目前的样品处理方法不能达到对细胞内病原微生物感染的定量提取和纯化。因此目前对细胞内病原微生物感染的检测都是定性而非定量的。

常规的病原体的提取和纯化和检测前处理方法有：

1.水煮法

使用一定浓度的表面活性剂如TRATON X-100，NP-40等的水溶液通过加热等方法使核酸从细胞中裂解释放出来。该方法的优点是操作简单，成本底。缺点是没有对样本核酸进行纯化，导致检测结果不稳定。

2.含硅材料吸附法

这是一个广泛使用的核酸提取纯化方法。该方法是利用核酸分子(DNA、RNA和DNA与RNA的杂交分子)在结合剂存在下可以和含硅材料(象二氧化硅、玻璃粉、玻璃、硅藻土和含硅磁珠等)可逆性吸附的原理。在结合剂中，最重要的是离液剂(chaotrope，chaotropicagent)，包括离液盐(chaotropic salt)。常用的离液剂包括碘化钠(NaI)、尿素、盐酸胍(Gu·HCl)、硫氰酸胍、高氯酸钠(NaClO₄)和溴化钾(KBr)。也有使用醇类作为结合剂的，例如50％的乙醇。这个方法通常有四个步骤：1)使用表面活性剂和蛋白酶将核酸与其它物质分离。2)在结合剂的存在下溶液中核酸与含硅材料结合。3)使用一种溶液(通常主要成分是60-80％的乙醇)将含硅材料上吸附的杂质洗去。4)用纯水或1mM TE溶液将吸附在含硅材料上的核酸洗脱下来。

另一个被广泛使用的方法是使用填充有硅胶膜的离心柱，离心柱中的含硅材料膜是核酸的吸附载体。通过离心过程分离液相和固相。

还有一种方法是利用含硅材料包裹的微小磁珠作为吸附核酸的固相载体。其原理和离心柱法相似。只是固相液相分离是利用磁力。

3.其它方法

其他的检测方法还有盐析法、醇沉淀法等。虽然这些方法是经典的方法，但是操作比较烦琐，得到的核酸纯度较低。

上述这些方法的缺点是它们都不能对细胞内病原微生物核酸进行定量的提取和纯化，其原因是无法对细胞样品中的病原微生物核酸量相对于样品细胞数量进行地定量，因为无法确定所检测的病原微生物核酸取样于多少个样品细胞。在临床检验中，定量采集细胞标本在绝大多数情况下是不可行的。对标本中的细胞数进行测量对部分标本在理论上是可行的，但是会增加检测成本和时间而且还有可能导致标本中的核酸降解，实际应用中难以实现。因而，到目前为止对所有的细胞内病原微生物感染的基因检测都是定性的，现有方法均无法进行定量检测。

由于对于各种细胞内病原微生物感染进行定性和定量的基因检测，可以为临床提供关键的治疗依据，尤其是定量检测，往往能对快速地进行临床诊断并制定相应的治疗方案提供有价值的信息。因此，需要一种能够对哺乳细胞内病原微生物进行定量检测的快速简便的检测方法，以满足临床诊断和治疗的需要。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题和技术难点，本发明的目的是提供了一种细胞内病原微生物核酸定量提取和纯化方法。使得临床定量检测细胞内病原微生物感染成为可能。

为达到此目的，本发明人巧妙地利用了每个宿主细胞都有恒量的基因组DNA的事实以及在特定条件下吸附载体对宿主细胞基因组DNA和病原微生物核酸有相同亲和力这一特性，以宿主细胞基因组DNA量作为宿主细胞数量的测量指标，通过定量吸附基因组DNA和病原微生物核酸在提取和纯化核酸的同时又完成了定量取样。

下面对上述方法的原理进行详细地描述。