[发明专利]人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗体RD9及其制备与应用

说明书

(一)技术领域：

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗狂犬病毒的抗体及其制备与应用，尤其是一种人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗体RD9及其制备与应用。

(二)背景技术：

狂犬病是死亡率最高的传染病，病死率为100％。狂犬病在世界范围内广泛分布，全世界每年有6万多人死于狂犬病。我国也属于狂犬病高发国家。目前，又一次狂犬病流行高峰正在我国形成！狂犬病的防治已成为我国最重要的公共卫生问题之一。人类要从地球上消灭狂犬病几乎是不可能的，因为狂犬病是人畜共生的疾病，而人类至今还不能控制动物狂犬病的发生。因此，狂犬病暴露后的预防是狂犬病防治的主要措施。对于严重暴露者(II型III型感染)，世界卫生组织建议同时应用疫苗和抗狂犬病抗体进行主动和被动联合治疗。人感染狂犬病毒的潜伏期一般为1至3个月，但也可短至一周就发病。因此，对于免疫系统发育不成熟的儿童，及免疫力低下不能及时产生抗体的人群，暴露后必须使用抗体进行防治。

人源单抗是临床用药的首选，但我国人源抗体的研制尚处于起步阶段，主要由于各种抗体技术平台有待于构建，另外，真核系统发酵技术的局限亦是抗体制备的主要瓶颈之一。

人源克隆展示技术(cloning display)的出现是人源抗体制备史上的里程碑，是一种筛选蛋白质的强有力工具，该技术将基因型和蛋白表型联系在一起，利用目标蛋白的特异性配基可从蛋白质展示文库中筛选出目标蛋白并找到相应的基因序列。过去，应用较多的展示技术有噬菌体展示(phage display)、细菌表面展示(bacterial surface display)、酵母展示(yeast display)等。但这些技术必须依赖细胞，由于受细菌转化效率、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白酶降解等限制因素的影响，库容量及其分子多样性都受到限制。为克服以上缺点，20世纪90年代中期另一种新的体外展示技术一核糖体展示技术(ribosome display)应用而生，由于该技术完全在体外进行，弥补了细胞内展示的不足，能显著增加库容量及分子多样性，库容量可高达10¹³～10¹⁵，比噬菌体展示文库(约10⁹)提高了10⁴～10⁶倍。此外，核糖体展示技术建库简便、易于筛选，为特异性人源抗体的制备注入了新的活力，显示出了诱人的发展前景。

目前最多报道的基因工程抗体是scFv，scFv-Fc和Fab等，scFv在多种疾病的诊断中作出了很大贡献，但是由于其空间结构的不稳定性极大的限制了其在临床治疗中的应用。scFv-Fc和Fab由于分子较大，含有多个糖基化位点，原核系统中难以完成抗体的成熟，常常要求在真核系统中表达制备，但由于目前在真核细胞中发酵技术的局限使之难以形成规模化生产。

三结构域抗体可以明显改进scFv的稳定性，其改构策略是应用人IGg(CH1)5’端12个氨基酸(AKTTAPSVYPLA)代替scFv的Linker(Gly4Ser)3，改构以后的抗体稳定性有明显改进，分析原因可能由于CH1可以提供并维持抗体分子的有效空间构象。而且，三结构域抗体具有以下特点：结构简单，易于构建；从血管进入其他组织的能力，包括通过血脑屏障的能力均强于全分子抗体，使进入中枢神经系统中的狂犬病毒的清除成为可能；而且，易于在原核系统中制备可溶性有活性的抗体。因此，三结构域抗体是一种很有前景的预防和治疗狂犬病的临床用小分子抗体。

在各种情况下，开发和研制一种新抗狂犬病毒的抗体，使其可以用作有效预防和治疗狂犬病的药物则成为现阶段生物技术工作者亟待解决的重要课题。

(三)发明内容：

本发明的目的在于提供一种人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性基因工程抗体RD9及其制备与应用，所述抗体是利用分子生物学技术----核糖体展示技术筛选到了一株针对狂犬病毒糖蛋白(Gp)的人源抗体基因RD9，并实现了此株抗体在原核系统的高效表达，其生物学特性研究表明RD9是一株高亲和力，稳定性较好，结构简单，易于构建的可以特异中和狂犬病毒的人源基因工程抗体，其基因和其基因产物可用于制备预防和治疗狂犬病的临床用药；所述抗体的制备方法易于规模化工业生产。

本发明的另一目的在于所述抗体的重链和轻链可变区基因及其编码的多肽在预防和治疗狂犬病药物中的应用。

本发明的技术方案：