[发明专利]固定化蛋白酶及其在制备乳酪蛋白肽中的应用方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化酶及其应用，尤其涉及一种固定化蛋白酶，本发明还涉及该固定化蛋白酶在制备乳酪蛋白肽中的应用，属于食品生物技术领域。

背景技术

功能性食品是二十一世纪食品工业发展的重点。开发各种具有生理活性的功能营养因子，具有深远的生物学意义和重要的应用价值，也是当今国内外食品界最热门的研究课题和极具发展前景的产业。

乳中含有大量不同活性的生物活性肽，这些肽或自然存在于乳中或源于乳蛋白水解后的产物。由于其分子量较小，在小肠内以完整肽段的形式被人体吸收，不会引起人体的免疫排斥反应，且具有多种特殊的生理活性功能。

乳酪蛋白经蛋白酶水解得到小分子乳酪蛋白肽，乳酪蛋白肽主要是由2～7个氨基酸组成的多肽混合物，是一种多功能营养因子，具有免疫调节、抗血栓、抗高血压、降胆固醇、抗菌等多种生理活性功能，可广泛应用于食品和医药等行业，可制成天然降血压药、患者营养补剂、婴幼儿食品、老年食品、运动食品和各种功能健康食品等。

乳源生物活性肽，因其源于天然食物蛋白以及多种特殊的生理活性功能，已成为发达国家的研究热点。经过近20年的探索，到目前为止，已经发现了多种乳源生物活性肽。国外对乳蛋白来源的ACE抑制肽研究有一定的报道，尤其是日本对来源于乳清蛋白、酪蛋白和酸奶中的ACE抑制肽进行了较多的研究，取得了较大的进展。目前国内对此方面的研究才刚刚起步，国内数所高校进行了乳源生物活性肽的研究，在蛋白酶的选择，酶解工艺等方面取得了一定的进展。但目前只有极少数的生物活性肽能够进行规模化生产，如CPPs。对于大多数乳蛋白来源的活性肽来说，其工业化生产还有一定的难度，主要是因为这些生物活性肽在乳蛋白酶解液中的含量低，分离和提纯难度大，检测手段和技术不够成熟，这些都是阻碍乳蛋白源生物活性肽产业化的主要因素，也是今后研究工作的重点所在。

目前国内已有蛋白酶水解乳酪蛋白制取乳酪蛋白肽的研究，但关于固定化酶水解制备乳酪蛋白肽的研究尚未见报道。

发明内容

本发明目的之一是提供一种固定化蛋白酶。

本发明目的之二是将该固定化蛋白酶应用于制备乳酪蛋白肽。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种固定化蛋白酶，主要按照以下方法制备得到：

(1)将浓度为0.5～10％的壳聚糖酸性溶胶，搅拌，使溶胶液滴均匀分散，滴入体积分数为2.5％的戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(按体积分数计)达到0.2-3％，搅拌加入0.5-3mol/L NaOH溶液，至NaOH溶液的终浓度(按体积分数计)为0.05％～3％，于40-70℃保温反应0.5-5h，静置冷却后弃去上层，依次用丙酮、无水乙醇抽洗，最后用蒸馏水冲洗，真空干燥，得到固定化载体壳聚糖微球，备用；

(2)向0.1％～5％的蛋白酶溶液中加入步骤(1)所制备的固定化载体壳聚糖微球，其中，蛋白酶溶液与固定化载体壳聚糖微球按1-4∶1的重量比进行配比；置于摇瓶器中振荡吸附2-30h，然后滴入体积分数为2.5％戊二醛溶液，使戊二醛溶液的最终浓度(按体积分数计)达到0.2-3％，交联0.2-10h，得到固定化蛋白酶。

其中，所述的蛋白酶优选自木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶、碱性蛋白酶或胃蛋白酶中的任意一种或一种以上按任意比例所组成的复合酶。

根据需要，将本发明所制备得到的固定化蛋白酶装入或填充入合适的柱中(作为参考，柱子材质可以为玻璃、工程塑料或不锈钢等材料，直径可以为Φ50mm，长度可以为1200mm，装填系数可以为85-90％等；当然，本领域技术技术人员可根据需要将上述参数作相应的修改)，得到固定化蛋白酶柱，可将其应用于制备乳酪蛋白肽。

作为一种优选的方法，一种将上述固定化蛋白酶柱应用于制备乳酪蛋白肽的方法，包括以下步骤：(1)预处理乳酪蛋白溶液；(2)将经过预处理的乳酪蛋白溶液过固定化蛋白酶柱，进行酶水解反应；(3)收集酶水解液，离心分离，得上清液；(4)将上清液脱色处理后再进行脱盐处理；(5)将脱盐处理后的酶解液进行纳滤处理；(6)浓缩；(7)浓缩后的产物包埋于壁材中；(8)喷雾干燥，即得乳酪蛋白肽。

为了达到更好的技术效果，步骤(1)中所述的预处理优选为：将乳酪蛋白配制成浓度为1.0-6.0mg/mL的溶液在60-100℃温度条件下预热处理5-20min；然后将乳酪蛋白溶液冷却至30-60℃；