[发明专利]一种用于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种家蚕DNA的抽提方法，具体涉及到一种适合于限制片段长 度多态性研究的家蚕DNA抽提方法。

背景技术

限制片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism， RFLP)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研 究。这一技术的开展需要以个体作为研究对象，即需要抽提出个体内高纯度和 高浓度的DNA，用于RFLP的相关研究。

家蚕(Bombyx mori L.)是重要的经济昆虫，也是用于遗传学及分子生物 学研究的模式昆虫。现有技术中，提取家蚕的DNA用于RFLP研究的技术主要 有以下几种：

(1)常规的DNA抽提方法：是将家蚕整头一起进行研磨。

由于蚕体含有大量蛋白、脂类及色素，抽提出的DNA纯度较低(OD_260/280＜ 1.8)，进行RFLP检测时，限制性酶切往往切不彻底，不能进行RFLP研究。

(2)将多头家蚕的后部丝腺混在一起进行DNA抽提。

虽然DNA的量是达到了RFLP研究的要求，但RFLP的研究需要DNA样品来 源于个体而不是群体。

(3)目前国内有些实验室也尝试从家蚕个体后部丝腺抽提DNA做RFLP，但 由于传统的抽提方法在抽提过程DNA损失量过大，只有10μg左右，不能对结 果进行重复试验，DNA的样就用完了。

要开展对个体作为研究对象的RFLP检测，需要优化DNA的抽提方法，抽 提出高质量(OD_260/280＞1.9)的足够多(100μg以上)的DNA样品。

发明内容

本发明目的是提供一种适合于限制片段长度多态性研究的家蚕DNA抽提 方法，该方法能够抽提出高质量，高纯度的家蚕DNA样品用于RFLP研究。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种适合于限制片段长度多 态性研究的家蚕DNA抽提的方法，包括解剖家蚕取出后部丝腺，从家蚕个体 的后部丝腺抽提DNA，再采用RNase酶消解RNA，所述解剖家蚕取出后部丝 腺的具体步骤为：在无菌条件下解剖家蚕，取后部丝腺，经磷酸盐缓冲液冲洗， 将后部丝腺研磨至粉末；其中，从后部丝腺抽提DNA和采用RNase酶消解 RNA的具体步骤为：

(1)采用DNA酶解缓冲液融化后部丝腺粉末，混匀后将溶液于48～55℃水 浴裂解6～8小时；

(2)加入与步骤(1)中溶液等体积的饱和酚，混匀后离心，取上清液；取与上 清液等体积的正丁醇与上清液混匀，离心后弃上清液，重复离心弃上清液的过 程至少1次，浓缩至0.1ml以下；采用无水乙醇和醋酸钠析出DNA，然后用 TE缓冲液溶解DNA，混匀后至少放置0.5小时；

(3)于35～39℃水浴中，采用RNase酶处理步骤(2)中的DNA溶液，消解去 除RNA；加入与DNA溶液等体积的饱和酚，混匀后离心，除去下层的酚层， 再加入同样体积的饱和酚，混匀后离心，取上清液；

(4)取与步骤(3)中的饱和酚等体积的酚氯仿，与步骤(3)所得的上清液混匀后 离心，再取上清液，并取与之等体积的正丁醇混合均匀，离心后弃上清，重复 离心弃上清的过程至少1次，浓缩至0.1ml以下；采用无水乙醇和醋酸钠析出 DNA，用70～75％的乙醇洗涤，溶解于TE缓冲液中。

上述技术方案中，所述磷酸盐缓冲液(PBS缓冲液)的成分和浓度为：

氯化钠NaCl            137mmol/L，

氯化钾KCl             2.7mmol/L，

磷酸氢二钠Na₂HPO₄     4.3mmol/L，

磷酸二氢钾KH₂PO₄      1.4mmol/L；

所述DNA酶解缓冲液的组分和浓度为：

蛋白酶K               0.2mg/ml，

十二烷基硫酸钠SDS     0.5％(重量比)，

四乙酸二氨基乙烯EDTA              0.05M；