[发明专利]一种染色体步移文库的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及染色题步移文库的构建方法，本发明还涉及用于构建文库的接头分子设计方法。

背景技术

目前，构建染色体步移文库的构建都是利用能产生平末端的DNA内切酶对基因组进行酶切，然后酶切产物直接与接头进行连接而成。但是能产生平末端的DNA内切酶相对于能产生粘性末端的DNA内切酶来说，种类较少，而且价格普遍较高，大大限制了构建染色体步移文库的种类、增加了文库构建的成本。另外，构建染色体步移文库所需要的接头，在设计上难以保证染色体步移PCR朝着预计的方向进行或者容易出现非特异性条带，严重降低了染色体步移PCR的扩增效率和PCR产物的准确性。

发明内容

针对上述不足，本发明提供了一种染色体步移文库的构建方法及其接头分子设计。利用本方法可以选择任何DNA内切酶对基因组进行酶切，包括能产生平末端的DNA内切酶、平末端DNA内切酶与粘性末端DNA内切酶的组合以及不同粘性末端DNA内切酶的组合等，酶切产物经过处理可直接与接头连接，大大增加了构建文库的种类、降低了构建文库的成本；利用DNA合成的原理，通过对接头末端核苷酸的分子设计则使染色体步移PCR按照预期的方向进行，能有效提高染色体步移PCR的扩增效率和PCR产物的准确性。

为实现上述目的，本发明的技术方案是采用粘性末端内切酶对基因组DNA进行消化，然后，通过单链核酸外切酶将突出的单链消化，从而将粘性末端转化成平末端。然后可按照常规的方法构建文库。然而，本发明方法并不仅局限于使用粘性末端内切酶消化基因组DNA，可以将平末端DNA内切酶与粘性末端DNA内切酶相组合，并按照上述方法构建文库。因此，本发明的方案是至少使用一种粘性末端限制性内切酶消化基因组DNA，并用单链外切酶将突出的单链消化，并构建文库。

在染色体步移构建文库时，对基因组DNA的酶切，如果选用的是产生粘性末端的内切酶，可利用具有单链DNA外切酶功能的酶制剂对其进行消化，使其产生平末端的基因组DNA片段。5’突出端的酶切产物采用具有5’-3’单链DNA外切酶进行消化，如枯草芽孢杆菌核酸外切酶、核酸外切酶VII(E.coli)、粗糙脉孢菌核酸外切酶等。3’突出端的酶切产物采用具有3’-5’单链DNA外切酶进行消化，如核酸外切酶I(E.coli)DNA聚合I(E.coli)核酸外切酶III(E.coli)及pfu DNA聚合酶等。

此外，为防止非特异条带的出现、控制染色体步移PCR的方向，本发明还提供了一种接头序列，其是由一条由50个碱基左右(如40-60bp，优选50bp)的长链和一条10个碱基左右(如8-15bp，优选10bp)的短链退火形成，其中短链序列与长链的3’端序列完全互补，使接头端的PCR引物只能以基因特异引物扩增的条带为模板，提高PCR扩增产物的特异性；为防止接头短链以长链为模板合成长链的互补连，需要对短链3’端最后一个碱基进行分子设计，使其核糖中的第三个碳原子上的羟基进行脱氧或者转换为一个甲基或者磷酸化，以阻止DNA聚合酶以接头短链为引物进行延伸。

应用本发明方法，可任意选择DNA内切酶构建染色体步移文库，扩大了文库的种类，使获得染色体步移实验结果的效率大大提高，同时降低了文库构建的成本；对接头进行的分子设计，可保证染色体步移PCR只能以基因特异引物扩增的条带为模板，有效抑制非特异条带的出现。

附图说明

图1是常用的平末端DNA内切酶对基因组DNA酶切结果的示意图；

图2是5’端突出DNA内切酶酶切结果示意图；

图3是3’端突出DNA内切酶酶切结果示意图；

图4是平末端和3’端突出DNA内切酶酶切结果示意图；

图5是平末端和5’端突出DNA内切酶酶切结果示意图；

图6是图2、3、4、5实验结果被相应的具有单链DNA外切酶消平后的结果示意图；

图7是3’末端碱基甲基化的接头分子序列图，其中CH₃N表示任意核苷酸(CH₃A、CH₃T、CH₃G、CH₃C)中，核糖的第三个碳原子上的羟基转换为甲基；

图8是3’末端碱基双脱氧化的接头分子序列图，其中ddN表示任意的双脱氧核糖核苷酸(ddA、ddT、ddG、ddC)；