[发明专利]一株吉氏芽孢杆菌突变株及其发酵生产碱性果胶酶

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域。

技术背景

目前碱性果胶酶在生物工程领域的应用越来越广泛，其应用领域包括：棉纤维的生物精练、植物韧皮纤维脱胶、造纸、处理果胶废水、咖啡和茶发酵、洗涤剂等。中国专利(公开号：CN 1480529A)中公开了一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)CCTCC No：M203042经液体深层发酵生产碱性果胶酶，可用于棉纺织物精练处理。中国专利(公开号：CN 1177003A)中公开了一株嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alcalophilus)CCTCCM96009能直接用于苎麻脱胶。中国专利(公开号：CN 1113951A)中公开了一株枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)CCTCC No：0213经高浓度液态发酵生产碱性果胶酶。我们从碱性土壤中分离筛选出一株嗜碱细菌，具有较高的产碱性果胶酶能力，经鉴定为吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)，已申请中国专利(公开号：CN1605627)，公开了该株嗜碱细菌(CGMCC No：1215)经固态发酵生产碱性果胶酶。我们也研究过该菌株发酵生产碱性果胶酶的性质(张保国，白志辉，李祖明，张国政，张洪勋.吉氏芽孢杆菌S-2菌株固态发酵制备碱性果胶酶.食品科技.2004，12：8-11)。本发明将该原始菌株进行紫外诱变，得到高产碱性果胶酶的突变株吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)2249，目前还没有用该突变株菌株进行发酵生产碱性果胶酶的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一株嗜碱细菌吉劳氏芽孢杆菌的突变株，它具有很高的产碱性果胶酶能力；并提供一种利用该菌株发酵生产碱性果胶酶的方法。

该菌株是将从碱性土壤中分离得到的吉氏芽孢杆菌产碱性果胶酶菌株，经紫外诱变得到的碱性果胶酶高产突变株吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)2249，其产碱性果胶酶的能力比原始菌株提高68％，经连续培养性能稳定。菌种保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.2249。

采用该菌株进行固态发酵生产碱性果胶酶的步骤如下：

1、菌种保藏。吉氏芽孢杆菌突变株2249保藏于4℃冰箱内碱性琼脂培养基斜面，半年转接一次。培养基组成：胰蛋白胨1.5％，大豆蛋白胨0.2％，酵母浸膏0.3％，葡萄糖0.2％，NaCl 0.2％，K₂HPO₄ 0.12％，NaCO₃ 0.3％，琼脂1.5％，于115℃灭菌15分钟。

2、种子培养。液体培养基组成：果胶0.5％，酵母浸膏1％，MgSO₄·7H₂O 0.05％，K₂HPO₄0.1％，NaCO₃ 0.3％；于115℃灭菌15分钟。接种，35℃摇瓶培养24小时，既得液体种子。

3、固态发酵。产碱性果胶酶固态培养基是向含果胶固体生物质(甜菜粕、麸皮、葵花盘、橘皮、橙皮、米糠、苹果渣等)中添加3倍重量的营养液制成，营养液组成：酵母膏1.0％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钠0.8％。甜菜粕和营养液分别于115℃灭菌15分钟，按重量比1∶3混合均匀，接种液体种子，于35℃静态培养72小时。

4、酶的提取和净化。固态发酵后的物料，加入10倍重量的pH为10的0.05mol/L的Na₂CO₃/NaHCO₃缓冲溶液，浸泡30分钟，在高速离心机中进行固液分离，提取液用孔径0.1μm的微滤膜过滤除去菌体，滤液用截留分子量为10000的超滤膜浓缩，收集浓缩液，即碱性果胶酶溶液，贮藏。

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的精神实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：不同含果胶生物质对产酶影响

分别在5g含果胶固体生物质中加入3倍重量的营养液，营养液组成：酵母膏1.0％，磷酸二氢钾0.05％，碳酸钠0.8％。甜菜粕和营养液分别于115℃灭菌15分钟，按重量比1∶3混合均匀，接种液体种子，于35℃静态培养72小时。结果见表1。

表1：各种含果胶生物质对产酶影响