[发明专利]一种重组多型汉逊酵母菌及其专用重组表达载体与应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组多型汉逊酵母菌及其专用重组表达载体与应用。

背景技术

尿酸氧化酶(Urateoxidase，Uricase，EC.1.7.3.3)是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，催化尿酸氧化为尿囊素和过氧化氢，尿囊素是除人和猿类以外的其它哺乳动物嘌呤代谢的排泄物。但在高等哺乳动物(猿和人类)体内没有尿酸氧化酶，而以尿酸作为嘌呤代谢的终产物。尿酸及其盐类在血液中溶解度很低，如果体内嘌呤代谢紊乱，产生过量尿酸，或者尿酸排泄受阻，血液中尿酸浓度增高，形成高尿酸症，长期尿酸过高就会引起痛风。尿酸氧化酶是一种重要的医药用酶。在临床上，被广泛用于尿酸的检测及痛风、高尿酸血症和肿瘤溶解综合征的治疗。

微生物是尿酸氧化酶的重要来源，目前来源于细菌、酵母菌和丝状真菌的尿酸氧化酶已被分离。但天然来源的尿酸氧化酶由于受产酶条件及产酶水平的影响，而限制了在商业化生产中的有效应用，因此尿酸氧化酶的异源表达逐渐成为研究的热点。已有不同来源的尿酸氧化酶在大肠杆菌和酿酒酵母中进行了异源表达，虽然都获得了有生物活性的蛋白质产物，但仍然存在酶产量低，分离纯化程序复杂的问题。更为重要的是天然来源的酶或在大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达的酶抗原性高，必须经过修饰才能应用于临床治疗上。

近年来，汉逊酵母作为外源基因表达系统越来越受到人们的重视。由于其表达的外源蛋白抗原性低而成为生产具有重要医用价值蛋白质的理想的微生物细胞工厂。但目前在国内外还没有尿酸氧化酶在汉逊酵母中表达的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组多型汉逊酵母菌及其专用重组表达载体与应用。

本发明所提供的重组表达载体，是含有如下表达盒的重组酵母表达载体；所述表达盒从上游至下游依次包括甲醇氧化酶基因的启动子、尿酸氧化酶基因和转录终止子。

其中，上述重组表达载体中的所述尿酸氧化酶基因为编码如下蛋白(a)或(b)的基因：

(a)由GenBank Acession No.BAA06804的自氨基末端第1-303位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基且具有尿酸氧化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明中所述尿酸氧化酶基因来源于产朊假丝酵母(Candida utilis)CGMCC 2.120(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心)。并且，所述表达盒还包括酿酒酵母α因子信号肽的编码序列，所述酿酒酵母α因子信号肽的编码序列位于所述甲醇氧化酶基因的启动子和所述尿酸氧化酶基因之间，且与所述尿酸氧化酶基因形成融合基因。

其中，所述酿酒酵母α因子信号肽的编码序列是编码如下蛋白的DNA分子：由GenBank Acession No.M55016的自氨基末端第1-89位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述重组表达载体中含有的所述甲醇氧化酶基因启动子为如下a)或b)的DNA分子：

a)GenBank Acession No.A11156的核苷酸序列自5′端1-1510位脱氧核糖核苷酸所示的DNA分子；

b)严格条件下与a)限定的DNA序列杂交的DNA分子；

上述严格条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。

所述酵母表达载体具体可为pGAPZ-alpha-A，所述乙醇氧化酶基因的终止子序列来源于所述载体pGAPZ-alpha-A，所述载体pGAPZ-alpha-A上还带有Zeocin抗性基因。

本发明提供的重组多型汉逊酵母也属于本发明的保护范围。

本发明所述的重组多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)，是将所述重组表达载体导入多型汉逊酵母菌中得到重组菌。

所述载体导入的酵母宿主优选为多型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)CGMCC 2.2498。

本发明得到的能稳定分泌表达尿酸氧化酶的重组多型汉逊酵母菌(Hansenula polymorpha)HPMU6，已于2008年1月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区大屯路)，保藏编号为CGMCC No.2351。其菌落呈凸起状、乳白色、有光泽、边缘整齐，细胞呈椭圆形，该菌株的最适生长温度为37℃，生长最适pH为5.5。

本发明中构建所述重组多型汉逊酵母的方法包括以下步骤：