[发明专利]端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法

权利要求书

1、一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系，已于2008年2月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心》，其保藏号为CGMCCNo.2372。

2、如权利要求1所述的端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系，其建立步骤如下：

(1)、包装细胞的筛选及病毒上清的收获；

(2)、病毒感染原代培养人胚前脑神经前体细胞；

(3)、克隆法筛选hTERT+人胚前脑神经前体细胞；

(4)、hTERT⁺人胚前脑神经前体细胞的扩增培养，利用免疫细胞化学，RT-PCR，以及电生理功能等方法对扩增的细胞进行特征测定，证明所获得的细胞是获得端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系。

3、根据权利要求2所述的端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系的建立方法，其特征在于：

所述步骤(1)的具体步骤如下：

(a)对数生长期PG13/JH1/hTERT包装细胞经0.25％胰蛋白酶消化后计数；

(b)用DMEM完全培养基将细胞稀释至浓度为100细胞/mL；取0.1mL细胞悬液接种于48孔板中，补加0.4mL完全培养液；37℃，5％CO₂条件下培养，每周半量换液，培养2-3周；

(c)相差显微镜观察定期观察48孔板中细胞生长状况；当细胞生长至60-80％汇合时，分别将细胞消化接种于6孔板中；继续培养；

(d)荧光显微镜定期观察各组细胞的荧光强度；培养1周后，挑选荧光较强的细胞扩增培养；

(e)收集培养液即病毒上清，用0.45μm低蛋白吸附膜过滤，分装1.5mL，-70℃保存；

所述步骤(2)的具体步骤如下：

(a)孕12周的人类胚胎前脑神经前体细胞分离计数后，按5×10⁵/mL的细胞密度接种于预先包被PLL的75cm²培养瓶中，加入10mL FBS-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养12小时；将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基；

(b)原代分离的人神经前体细胞在GF-NSA培养基中生长72小时后进行病毒感染；弃培养液，加入高滴度的hTERT病毒上清6mL，GF-NSA完全培养基4mL，加入polybrene使其终浓度为8μg/mL，37℃，5％CO₂培养12小时；弃病毒上清，换成新鲜GF-NSA培养基，继续培养；细胞生长密度达到80-90％汇合后，传代；

(c)病毒感染步骤分别在第2、3代重复两次；

所述步骤(3)的具体步骤如下：

(a)病毒感染后的细胞消化后制成细胞悬液，计数；将细胞悬液稀释至2×10³/mL接种于包被PLL的75cm²培养瓶中，每瓶1mL细胞悬液，37℃，5％CO₂培养；

(b)定期观察细胞的生长，当出现明显的细胞克隆后，荧光显微镜观察各细胞克隆的荧光强度，并标记；

(c)克隆片定点消化表达荧光的细胞克隆，将细胞接种于24孔板中，然后依次通过6孔板，25cm²培养瓶进行扩增培养；

所述步骤(4)的具体步骤如下：

(a)筛选后的细胞，接种于包被PLL的培养中生长，培养基为GF-NSA培养基，37℃，5％CO₂培养；每3天换液一次，每7-10天传代一次；

(b)传代方式：培养细胞生长至90％汇合期，弃培养基，用0.025％胰蛋白酶/0.002％EDTA消化细胞1-3分钟，弃消化液，加入FBS-NSA培养基，进行吹打；细胞重悬于FBS-NSA培养基中，按1∶2的比例将细胞接种于PLL包被的培养瓶中，37℃，培养2小时，然后将FBS-NSA培养基换成GF-NSA培养基继续培养，获得端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系hSN12W-TERT。