[发明专利]端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞系及其建立方法和应用，具体涉及一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系及其建立方法和应用，它属于神经系统疾病基础研究以及临床应用领域。

背景技术

中枢神经系统疾病，如退行性变疾病帕金森病(PD)、老年痴呆(AD)以及急性损伤性疾病脑出血、脑梗塞等等，一般都很难治愈，对个人和家庭都是贻害无穷。这是因为组成神经系统的细胞-神经元在出生后就已经完成了分裂、增殖和分化，死亡以后就不能获得新生神经元的取代，脑组织一旦损伤，即造成永久功能丧失。

上世纪未生命科学领域中具有划时代意义的重大进展-神经干细胞的发现为治疗这类疾病展现出光明的前景。神经干细胞(NSC)是藏匿于神经系统某些部位中的一类具有自我更新能力，并且能分化为本系统各种细胞如神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞等的多潜能细胞。这种多分化潜能和自我更新潜能可以维持相当长时间，甚至终生，且能对疾病或损伤发生应答，即神经干细胞及其分化后的子细胞可补充与替代疾病或损伤的神经细胞。

神经前体细胞(NPCs)是指具有一定增殖能力，但其具有较明确的分化方向，可以沿着某一谱系进一步分化为成熟神经系统的细胞。这些细胞同样保持相对原始的状态，具有良好的可塑性，可以通过基因工程或细胞工程等当代高新技术将之进行人工改造，使其发育成为能够对神经损伤特别是中枢神经损伤进行替代治疗的工具。如果我们能够将它们分离出来，能够在体外长期培养它们、扩增它们，驾驭它们能够按照我们的意愿来分化，就能够将它们用做治疗神经系统损伤的替代细胞，中枢神经系统疾病的治疗就有希望。

尽管近年来国内外的研究表明，利用体外分离技术可以使研究者在培养皿中获得人神经前体细胞，这些细胞可在有丝分裂源，碱性成纤维因子(bFGF)，表皮生长因子(EGF)作用下分裂增殖产生一定量的子代细胞。但人神经前体细胞在体外的生存期较短，即使通过改良培养方式，在培养体系中加入白血病抑制因子(LIF)等也不能无限延长体外神经前体细胞的生存期。体外培养人神经前体细胞的数量及质量已成为制约神经前体细胞应用的最主要因素。如何获得可供研究的、大量的人神经前体细胞，已成为目前研究迫切需要解决的一个问题。

通过基因工程方法建立起永生化的人神经前体细胞系，就可在一定程度上解决在体外大量扩增前体细胞的难题。神经前体细胞系特性均一，易于冷冻保存，易于进行转基因操作，易于在良好的质量监控下提供不同机构广泛应用。人神经前体细胞的永生化研究最早由Sah等于1997年首次报道，他们利用四环素调控的v-myc基因表达系统，建立了来源于人体胚胎13周全脑组织、具有单潜能及双潜能的永生化人神经前体细胞系。随后，Flax与Villa分别报道了v-myc永生化的多潜能人体胚胎神经前体细胞系B4和HNSC.100。但由于myc基因的表达不仅与细胞增殖和分化有关，而且与细胞的癌变也密切相关，给病人移植就有相当的致瘤危险。

细胞衰老及永生化的端粒假说表明，端粒酶活性的维持是细胞保持增殖能力的条件之一。通过外源基因导入重建端粒酶活性可以使增殖能力有限的细胞达到永生化。端粒酶永生化的细胞具有正常人二倍体核型；存在接触抑制现象和锚着依赖性特征；不具有致瘤性和软琼脂克隆形成能力；DNA被紫外线或电离辐射损伤后，p53和p16INK4a，K-Ras的反应性诱导与正常细胞相同。因而利用人端粒酶催化亚单位基因(hTERT)重建神经前体细胞端粒酶活性，成为永生化人神经前体细胞的一个新的方向。Roy及Bai于2004年分别报道了利用端粒酶基因建立永生化胚胎脊髓及SVZ区的人神经前体细胞系。但最新的研究表明，发育期的神经前体细胞具有较明确的区域特异性，不同脑区不同发育阶段的细胞具有不同的转录因子表达，而转录因子直接调控前体细胞在体内外定向分化的方向。因此，提供人类中枢神经系统疾病基础以及临床治疗研究用的永生化人前脑神经前体细胞系就成为该技术领域急需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种可供人类中枢神经系统疾病基础以及临床治疗研究用的永生化人前脑神经前体细胞系。

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：

一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞hSN12W-TERT，已于2008年2月21日保藏于《中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心》，其保藏号为CGMCC No.2372。

本发明的另一目的是提供上述端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞的培养方法。

一种端粒酶永生化人胚胎前脑神经前体细胞系，其建立步骤如下：