[发明专利]Ⅳ型胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种肝纤维化早期的检测指标IV胶原蛋白化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

肝脏是人体消化系统中最大的消化腺，又是新陈代谢的重要器官。肝纤维化是指肝脏纤维结缔组织的过度沉积，是纤维增生和纤维分解不平衡的结果，各种原因引起的肝细胞脂肪变、淤胆及炎症等，达到一定严重程度均可刺激肝内局部的贮脂细胞、静止的纤维母细胞增生并形成胶原纤维，增多的纤维组织形成细小的条索和菲薄的间隔，使肝脏纤维化变导致肝功能受损的综合症。肝纤维化是肝硬化的早期阶段，对它早期诊断、及时抗纤维化治疗，对肝硬化的防治、延缓、逆转等都起到极大的作用。

随着肝纤维化研究的深入，不断地揭示了胶原结构、功能与病理学的内在关系。尤其对IV型胶原蛋白(英文缩写CL-IV)的研究更加深入，在肝纤化的早期诊断上更有价值，因此检测血液中的IV胶原蛋白的含量对肝纤维化的诊断、治疗效果和愈后的判断具有重要意义。到目前为止，经肝穿刺或经腹腔镜肝活检，进行组织病理学检查仍是诊断肝纤维化和肝硬化的“金标准。但是肝活检技术也有其局限性，因为慢性肝炎等病变虽然是弥漫性的，但很难保证一次取材能反映整个肝脏的全貌，尤其是肝纤维化和肝硬化时细针负压肝穿刺难以获得足够的标本给诊断带来一定的困难。

目前，肝纤维化的血清学检测指标IV型胶原蛋白的检测方法主要有放免法和酶联免疫法。放射免疫分析法操作复杂、测定结果不稳定、试剂保存时间短、放射性污染、仪器昂贵等问题；而酶联免疫分析法灵敏度低，线性范围窄等缺点。

化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，是在抗原-抗体特异性识别基础上建立起来的一种新的非放射免疫分析技术--化学发光免疫分析技术，由于这种方法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，仪器设备简单，试剂价格低廉，方法稳定、快速等优点，更易推广应用。

发明内容

本发明的目的正是为了克服上述已有技术上的缺点与不足，采用抗人IV型胶原蛋白单抗包被微孔板的一种双抗体夹心一步法测定人血清中IV型胶原蛋白含量的抗人IV型胶原蛋白化学发光定量测定试剂盒，其特点是操作简便、快速、灵敏、稳定，可迅速、准确的判断和监控病程。

本发明提供了一种肝纤维化的指标IV型胶原蛋白(CL-IV)化学发光免疫分析定量测定试剂盒及其制备的方法。

根据本发明试剂盒包括：

1)IV型胶原蛋白校准品；

2)已包被亲和素的固相载体；

3)酶标记的IV型胶原蛋白的单抗或多抗；

4)生物素化的IV型胶原蛋白的单抗或多抗；以及

5)上述酶所作用的化学发光底物；

6)浓缩洗涤液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。

根据本发明的试剂盒，其中，所述标记酶为碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。

根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物为1，2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。

优选地，上述试剂盒中，所述1，2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-1，2-二氧乙烷、3-(2′-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3″-磷酰氧基)苯基-1，2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。

进一步，本发明提供了一种制备上述试剂盒的方法，包括以下步骤：

1)以IV型胶原蛋白纯品配制校准品；

2)以亲和素包被固相载体；

3)以酶标记IV型胶原蛋白的单抗或多抗；

4)使IV型胶原蛋白的单抗或多抗生物素化；

5)配制化学发光底物；

6)配制浓缩洗涤液；

7)分装上述IV型胶原蛋白的校准品、生物素化的IV型胶原蛋白单抗或多抗、酶标记的IV型胶原蛋白的抗体、该酶所作用的化学发光底物和浓缩洗涤液；以及

8)组装为成品。

在根据本发明的方法中，其中所述包被固相载体的步骤2)包括以下方法：

用0.050M pH值为9.6的碳酸盐缓冲液配制成所需浓度的亲和素包被液，并将包被液负载于固相载体上；经生理盐水洗涤、BSA封闭，抽湿干燥后用铝箔袋密封。

当IV型胶原蛋白的单抗或多抗酶标记物为辣根过氧化物酶时，采用过碘酸钠法进行标记，其具体原理为：辣根过氧化物酶为一种分子量为44,000的糖蛋白，含糖量达到18％。本发明使用过碘酸钠氧化与酶活性无关的糖基，生成的醛基与抗体上的氨基形成Sciff’s碱，接着加入硼氢化钠将其还原成稳定的结合物，最后往加入酶标记抗体中加入等量的甘油进行保存。