[发明专利]一种检测活病毒滴度的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测活病毒滴度的方法，尤其涉及一种采用酶联免疫斑点方法检测活病毒滴度的方法，属于生物制药领域。

背景技术

迄今为止，对于活病毒滴度的检测方法主要包括蚀斑法，终点稀释法和酶联免疫荧光法等三种，三种检测方法的主要检测过程及优缺点如下：

蚀斑法：该方法是测定病毒滴度最经典的方法，一般而言，1个蚀斑是由1个病毒粒子产生的，以蚀斑形成单位(PFU)表示。以水痘病毒为例，培养瓶内生长状态良好的2BS或MRC-5细胞传代到6孔细胞培养板，37℃5％CO₂培养箱培养到细胞形成单层进行试验。弃去培养液，加入合适稀释的水痘病毒，100ul/孔；37℃5％CO₂培养箱吸附，每20分钟摇匀一次，吸附40分钟；补加病毒培养液，3ml/孔，37℃5％CO₂培养箱培养8-10天；弃去病毒培养液，加入考马斯亮蓝染液，1ml/孔，染色10分钟；弃去染液，计蚀斑数，病毒滴度＝蚀斑数×稀释倍数×10(PFU/ml)。该方法存在几个方面的缺陷：1、检测时间长，一般需要8-10天；2、准确性不高，病毒感染细胞培养到8-10天，相邻的蚀斑可能联合到一起，降低了病毒滴度，也可能母斑病毒产生子斑，增加了病毒滴度，即导致试验重复性差；3、蚀斑只有数目多少，没有特异性表征，因而不能反映蚀斑是否由水痘病毒感染细胞引发的病变所致。

终点稀释法：以50％组织培养剂量(TCID₅₀)表示，TCID₅₀是指能使半数单层细胞孔(管)出现病变的病毒稀释度。以水痘病毒为例，培养瓶内生长状态良好的2BS或MRC-5细胞传代到96孔细胞培养板，37℃5％CO₂培养箱培养到细胞形成单层进行试验。取水痘病毒悬液，用病毒稀释液按10倍系列稀释(10^-1-10^-4)；稀释的病毒悬液加入到形成单层的组织培养细胞中，每稀释度感染4-12孔细胞，50ul/孔；37℃5％CO₂培养箱吸附40分钟；补加病毒培养液，50ul/孔，37℃5％CO₂培养箱培养8-10天；显微观察并记录每稀释度每孔细胞有无病变，记录的数据按Reed-Muench法或Karber计算病毒TCID₅₀值。该方法所存在的缺陷同蚀斑法一样，需要的时间长；结果观察需要显微操作，比较繁琐；也不能反映病斑的特异性。

酶联免疫荧光法：该方法的细胞培养、病毒感染培养同蚀斑法或终点稀释法。以96孔板为例，感染细胞培养24-48小时，弃去病毒维持液后，每孔加2％甲醛溶液100ul固定已感染的2BS细胞或MRC-5细胞；10分钟后，弃去甲醛溶液，用200ul PBS洗3次，2分钟/次；加50ulPBS稀释的1％牛血清白蛋白(BSA)到每个孔内孵育1小时；弃去BSA液，立即加入30ul人抗VZV血清，室温孵育1小时；用200ul PBS洗4次，2分钟/次；加入荧光素标记的羊抗人抗体，室温孵育1小时，然后用200ul PBS洗5次，2分钟/次；用装有CCD相机100X荧光显微镜观察每个孔的荧光灶，计数，荧光灶是由于感染所引起的；观察每孔中荧光灶数目，确定感染是否阳性；按标准方法计算病毒滴度(TCID₅₀)。该方法优点是检测所需的时间短，能反映病毒的特异性，但是，需要荧光显微镜，操作者需要专业经验，不同操作者之间测得结果相差较大。

总之，目前尚缺乏一种快速、准确、特异性高、检测成本低的活病毒滴度的检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的检测病毒滴度的方法，该方法不仅快速，而且可以反映检测的特异性。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

一种检测病毒滴度的方法，包括：

(1)将一步稀释或系列稀释的待检病毒感染贴壁细胞、培养后，用固定剂固定细胞；

(2)向已固定的细胞中加入病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；或者向已固定的细胞中加入辣根过氧化物酶标记的病毒抗血清或单克隆抗体，培养、洗涤，加入显色剂显色，产生红色或褐色斑点；

(3)根据以下公式计算病毒滴度：病毒滴度＝红色或褐色斑点均数×待检测病毒的稀释倍数÷待检测病毒感染贴壁细胞的剂量(毫升)；或者根据稀释度和产生红色或褐色斑点的孔数，计算病毒的lgTCID50值。