[发明专利]以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒

权利要求书

1、本发明涉及生物技术领域中一种以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒，由定向重组载体，定向扩增体系，定向连接复合物和鉴定引物中一种或者若干种构成；其特征在于，目的基因经过定向扩增以后和定向重组载体非定向连接，由限制性内切酶对错误连接产物在连接点处形成的酶切位点进行切割，使其难以进入宿主细胞或者进入细胞后难以复制，而正确连接的产物则不受其影响；最后通过鉴定引物和原扩增用引物联合对目的基因连接的状态进行鉴定。

2、根据权利要求1所述的定向基因重组试剂盒，其特征是：定向重组载体末端含有两个可以与目的基因连接的连接点A和B，连接点A和连接点B的碱基序列不同，优选但不限于单碱基G和单碱基C的组合，既连接点A的5’末端为G，连接点B的5’末端为C；或者连接点A的5’末端为C，连接点B的5’末端为G。

3、根据权力要求1所描述的定向基因重组试剂盒，其特征是：定向扩增体系由扩增体系、定向引物和模板构成；扩增体系是产物为平滑末端的耐热DNA聚合酶，dNTP，反应缓冲液混合组成的即用型混合物，用时加入定向引物和模板；定向引物由上游引物和下游引物构成，试剂盒提供合成方案；利用定向引物扩增完成后，目的基因两端为与相应载体连接所用的连接点a和b其中连接点a和连接点b中有一个或者两个全部含有不完整的限制性内切酶酶切位点。

4、根据权力要求1所描述的定向基因重组试剂盒，其特征是：权力要求2或权力要求3中所描述的定向目的基因和定向重组载体，其正确连接方式为载体连接点A和目的基因连接点a连接，载体连接点B和目的基因连接点b连接；错误连接方式为A和b连接，B和a连接；其中错误连接方式中形成的两个连接位点中一个或者两个全部形成完整的筛选用限制性内切酶酶切位点，优选但不限于一个筛选用酶切位点正确连接方式中连接点不形成限制性内切酶酶切位点，或者形成与错误连接时形成的筛选用酶切位点不同的限制性内切酶酶切位点。

5、根据权利要求1所述的定向基因重组试剂盒，其特征是：定向连接复合物由DNA连接酶和限制性核酸内切酶联合构成，其中连接酶或者限制性内切酶或者两者全部可以由用户自备定向连接复合物可以是上述两类工具酶的混合物，也可以是两类工具酶先后单独作用最后形成功能上的组合；其中限制性内切酶能够特异性识别权利要求(4)中所述的错误连接时形成的完整的筛选用限制性内切酶酶切位点，并对其进行切割，但对目的基因本身以及正向连接产物中形成的连接点和连接点附近的序列不能识别或者不能切割。

6、根据权力要求1所描述的基因重组试剂盒，其特征是：鉴定引物中上游引物和下游引物分别是目的基因和互补链5’一侧载体的同源序列；对重组产物进行PCR鉴定时，选用鉴定用上游引物和目的基因扩增用下游引物组合对重组产物进行扩增，或者选用鉴定用下游引物和目的基因扩增用上游引物组合对重组产物进行扩增；上述鉴定方法可用于确定载体中是否含有目的基因，以及目的基因的连接方式是否正确。