[发明专利]以连接后筛选为基础的定向基因重组试剂盒

说明书

技术领域

本发明是生物技术领域的一种新型定向基因重组试剂盒。目的基因首先以非定向方式与相应重组载体连接，之后对错误连接形成的特定选择位点进行连接后处理，使错误连接的目的基因难以进入宿主细胞或者进入宿主细胞后难以复制，重组产物可通过PCR对产物是否连入载体，连接方向是否正确进行鉴定。本方法可用于实验室小规模的普通科学研究，更适合于批量蛋白质的生产或筛选，尤其在生物信息学研究中具有很高的应用价值。

背景技术

自上世纪70年代PCR技术和限制性内切酶发现以来，基因重组技术已经形成了一套完善的体系，其中主要包括目的基因的分离，目的基因和重组载体的限制性切割，目的基因与重组载体的定向连接，宿主细胞的转化，阳性克隆的筛选等。目的基因和载体的连接有正向和反向两种方式，只有正向连接的基因才能够得到正确的表达，因此建立在双酶切基础上的定向连接是传统重组技术的核心。

目的基因和载体的切割和连接是基因重组过程中操作最为繁琐，工作周期最长，并且失败几率最高的步骤。目前国内外很多生物技术公司陆续都开发出了用于简化操作的试剂盒产品，比如凝胶回收试剂盒，PCR片段回收试剂盒，酶切片段回收试剂盒，快速连接试剂盒等，但仍然难以避免操作过程中基因片段的丢失。因此寻找更为简单的方法是必然的选择。

目前人们对定向重组技术的改造主要是通过以下两种方式实现的：

1、模拟自然条件下生物基因重组的原理。比如Clontech公司以同源重组为基础的In-fusion系统，Invitrogen公司以位点特异性重组为基础的Gateway系统，F.A.斯图尔特等的专利技术——应用同源重组克隆和亚克隆的方法和组合物(专利申请号00812739.5)等。自然重组技术不需要用户对目的基因进行切割和连接，只要将载体、目的基因和重组体系混合在一起处理适当的时间即可转化宿主细胞。但是，自然重组技术需要载体末端和目的基因末端之间存在20～40bp同源序列，需要特殊的重组酶系，极大的提高了基因重组的操作成本。而且同源重组是一个动态的双向过程，重组成功率一般不会太高，并不适合在国内普通实验室常规使用。

2、以体内连接方式实现定向重组。比如NEB公司在尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)基础上建立的的USER Friendly系统等，以及马立新等申请的尚未明确连接方式的两项专利技术——一种零背景高通量定向表达克隆的方法(专利申请号01133158.1)和一种高通量直接定向克隆构建重组腺病毒的方法(专利申请号200410060972.6)等。体内连接一般需要目的基因和载体之间具有4～12bp的互补序列，上述方法就是通过不同的方式在载体和目的基因之间建立这样一个互补序列。前者需要合成特殊的引物，而且需要特定的工具酶，工作成本较高；后者利用了一种常规的工具酶，对引物序列的要求相对较低，不过该发明专利尚未声明采用体内连接技术。上述体内重组技术要求载体必须具备一段游离单链序列，在反复冻溶过程中冻溶过程中这些游离序列很容易出现碱基脱落，影响连接效率，不适合长期应用，难以工业化生产。

上述技术分别从不同的角度发展了重组技术，但是受到技术本身的缺陷所导致的成本过高或者连接效率过低等因素的影响，并不能替代既往传统的重组技术进行常规应用。

以往在目的基因的克隆扩增阶段，对目的基因进入载体的方向没有特定的要求，可以通过非定向重组的方式连入载体。比如以Taq酶为基础的扩增产物可以直接连接进入TA克隆载体，目前很对生物公司也推出了相关的重组试剂盒。另外用其他耐热DNA聚合酶扩增得到的平滑末端扩增产物，同样可以直接连接到平末端载体中，不需要互补序列。随着连接技术的进步，TA克隆和平末端连接克服了连接困难的问题，NEB和Takara等生物公司推出的连接试剂盒在5～10分钟即可完成操作，目前上述技术已经在大部分实验室应用。

本发明在传统非定向重组的基础上引入连接后筛选过程，通过限制性内切酶对反向连接产物形成的特异性选择位点进行加工，使反向连接的重组产物丧失进入宿主细胞或者进入细胞后难以克隆扩增的能力，从而达到定向连接的目的。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的定向基因重组技术，使人们在不改变既往工作习惯的基础上，能够给通过简单的方式完成基因重组操作，并降低工作成本，缩短工作周期，提高基因重组的工作效率。