[发明专利]固定化混合菌种发酵纤维素水解液制备燃料乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种固定化混合菌种制备燃料乙醇的方法，具体地说是利用固定化嗜单宁管囊酵母(Pachysolen tannophilus)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的混合菌种发酵木质纤维素水解液制备燃料乙醇的生产方法。

背景技术

乙醇是一种重要的工业原料，广泛用于化工、食品、军工、日用化工和医药卫生等领域，还能作为能源工业的基础原料、燃料。当今世界面临着环境与发展的挑战，要求使用无铅汽油的呼声日益高涨。将乙醇进一步脱水再添加适量汽油后形成变形燃料乙醇，在国外乙醇被视为替代和节约汽油的最佳燃料，作为一种生物能源，乙醇有望取代日益减少的化石燃料(石油和煤炭)。

乙醇生产的主要原料有纤维素和半纤维素、淀粉和糖质原料等。其中纤维素和半纤维素是最丰富、廉价和易得的有机物质。据估计，地球上每年可产生1700亿吨左右的纤维素废渣，充分利用纤维素原料产生的己糖和木糖进行发酵是当今缓解能源危机的关键。

固定化技术在工业生产、环境工程等领域得到广泛应用。通过对细胞固定化，可以有效增加细胞浓度，提高产率。关于固定化细胞发酵制备酒精的方法，近年来已有专利公布。美国专利US4393136利用固定化运动发酵单胞菌发酵己糖制备乙醇；美国专利US4350765将酿酒酵母固定于海藻酸钙中来制备乙醇；美国专利US5254468将木糖异构酶和脲酶共固定化在双分子膜中，木糖异构化为木酮糖和木酮糖发酵乙醇同步进行。上述固定化技术对增加细胞浓度，提高乙醇产率有较好效果，但以单一细胞固定化为主，只能发酵单一的己糖和木糖，而纤维素水解液主要由己糖和木糖组成，同时利用两种糖共同发酵制备乙醇才是关键。同时，发酵菌种发酵能力不够强，木糖利用率低、发酵周期较长、乙醇产率较低等也是尚待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种发酵木质纤维素水解液制备燃料乙醇的方法。为了充分利用纤维素水解液中的己糖和木糖，采用固定化混合菌种共发酵生产燃料乙醇，为了解决固定化混合菌种发酵存在的问题，提供一种利用新的木糖发酵菌种与酿酒酵母共固定化，采用补料批式发酵方式发酵来提高乙醇浓度、缩短发酵周期、提高菌种的发酵能力。本发明包括以下步骤：

将嗜单宁管囊酵母(P.tannophilus)和酿酒酵母(S.cerevisiae)同时驯化，培养基中水解液的比例随着驯化次数的增加按20-50％的比例增长，至驯化培养基全部是水解液。将驯化培养的嗜单宁管囊酵母和酿酒酵母菌悬液按1∶1的比例接入3％的海藻酸钠溶液中，注入2％CaCl₂水溶液中，固化4h，无菌水洗涤海藻酸钠凝胶球(直径2-3mm)，移入1％硫酸铝溶液中，0-4℃下固化24h得到固定化混合菌种的凝胶球。

固定化的凝胶球放于增殖培养基中，30℃，100r/min条件下增殖培养20-48h，待增殖好后，将固定化凝胶球按20-50％的填充率加入到木质纤维素水解液的发酵培养基中，初始糖浓度为3-15％，调节pH值为3.0-7.0，在28-35℃、100-150r/min条件下摇床发酵，间隔12-24h后补充新鲜的水解糖液，进行补料分批发酵。

在上述制备步骤中：

所用的酵母菌为嗜单宁管囊酵母(pachysolen tannophilus)：北京化工大学保藏。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)：北京化工大学保藏。

对混合菌种进行驯化时，驯化培养配方为：木糖10-50g/L，葡萄糖10-50g/L，尿素2.5g/L，酵母膏5g/L，(NH₄)₂SO₄5g/L，KH₂PO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，水解液(20、40、60、70、80、100％)，pH自然。30℃，160rpm，每个批次驯化时间为18-24h，接种量10-20％。

对固定化混合菌种进行增殖培养时，增殖培养基配方为：木糖10-50g/L，葡萄糖10-50g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，KH₂PO₄1g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L。