[发明专利]一种D－氨基酸氧化酶融合蛋白及其载体和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体地说涉及一种D-氨基酸氧化酶融合蛋白及其表达载体；以及D-氨基酸氧化酶融合蛋白在制备戊二酰基-7-氨基头孢烷酸上的应用。

背景技术

D-氨基酸氧化酶(D-Amino acid oxidase，DAAO，EC1.4.3.3)是一种以黄素腺嘌呤(FAD)为辅酶的黄素蛋白，它对催化反应底物有高度的立体异构选择性和广谱性，被广泛用于D-氨基酸定性定量分析、生物传感器、L-氨基酸和α-酮酸生产等。它在工业上的重要应用之一即为两步酶法生产7-氨基头孢烷酸(7-ACA)(Pollegioni L等.Appl Microbiol Biotechnol，2008，78：1-16)。DAAO广泛存在于哺乳动物的内脏、藻类、真菌和细菌中(孙兵兵等.化学与生物工程.2007，24(2)：8-11)。研究人员对DAAO基因进行了一系列克隆、测序和重组表达研究，以实现其高效表达和酶的有效生产。其中，红酵母(Rhodotorulagracilis)和三角酵母(Trigonopsis variabilis)中表达的RgDAAO和TvDAAO在工业上的应用最为广泛，其cDNA序列同源性为26％(Pollegioni L等J.Biotechnol，1997，58(2)：115-123)。

针对D-氨基酸氧化酶的高表达和分离纯化研究主要集中在酶的改造和载体的构建筛选方面。百瑞全球有限公司的专利《重组D-氨基酸氧化酶》(专利号：ZL200410030842.8)提供了一种突变DAAO及其编码序列，其第53位的苏氨酸突变为其它氨基酸，酶活提高了25％以上。复旦大学的专利申请《一种制备D-氨基酸氧化酶的方法》(申请号：200410016825.9)，在毕赤酵母表达载体中引入6聚组氨酸标签(His-tag)，可进行三角酵母DAAO的高效分离。百瑞全球有限公司的专利申请《一种大肠杆菌表达载体及其应用》(申请号：200510089966.8)提供了一种用于高效表达DAAO大肠杆菌表达载体pRSET-A。

通过基因融合引入一些具有特异功能的蛋白或多肽，有可能改善表达宿主菌细胞的生长状况、提高目的蛋白的表达水平、改进目的蛋白的提取纯化方法以及从分子水平上提高酶的催化活性和稳定性等。常见的用于构建融合蛋白的特异性功能蛋白有大肠杆菌麦芽糖结合蛋白、硫氧化还原蛋白、谷胱甘肽转移酶、荧光蛋白、透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin，VHb)和多聚丝氨酸(Poly-Ser)、多聚组氨酸(Poly-His)等。

其中，VHb是透明颤菌在贫氧条件下合成的一种可溶性血红素蛋白分子，它的一个重要生理功能是从分子水平上提高细胞对氧气的利用能力，协助细胞在贫氧环境中生长(吴奕等.生物工程学报，1996，12(3)，276-283)；它还可以降低外源蛋白对细胞的毒性(Chien LJ等.Biotechnol Prog，2004，20：1359-1365)、提高重组目标蛋白表达的活性和稳定性(Khang Y等.BiotechBioeng，2003，82：480-488)以及增加目标产品在重组细胞内的产率(Yu HM等.FEMS Microbiol lett，2002，214：223-227)。VHb的开放阅读框有441bp(包括终止密码子)，编码146个氨基酸残基。而多聚氨基酸极性肽段的融合表达可以通过亲和层析方法实现目的蛋白的高效分离纯化。

头孢菌素类药物(Cephalosporins)是一族B-内酰胺类广谱抗生素，通过干扰细菌细胞壁的合成并加速细胞壁的破坏而起到杀菌的作用。头孢菌素的抗菌部位为其母核7-氨基头孢烷酸(7-aminocephalosporanic acid，7-ACA)，由双氢噻嗪环和β-内酰胺环融合而成，它是各类半合成头孢菌素类抗生素药物的重要中间体。7-ACA主要由头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)通过酶法或化学法裂解脱去7-位的D-α-氨基己二酰侧链得到。酶法具有工艺简单、安全、高效、无污染及产品质量稳定等优点，与传统的、污染严重的化学法相比具有较大的竞争优势，因而用酶法裂解CPC生产7-ACA已成为发展趋势。DAAO可以催化CPC生成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-amidocephalosporanic Acid，GL-7-ACA)中间产物，然后其在GL-7-ACA酰化酶的作用下脱去侧链，生成7-ACA。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种催化活性高的的D-氨基酸氧化酶融合蛋白。