[发明专利]一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法及试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染可以引起慢性肝炎、肝硬化，甚至肝癌。我国HBV感染者约为1.2亿，慢性乙型病毒性肝炎(慢乙肝)患者约3500万，其中约20％的患者将发展为肝硬化，约5~10％的患者将发生肝癌。目前国内、外尚无根治慢乙肝的有效药物和方法，因此，HBV感染导致的慢性肝炎、肝硬化不仅严重地威胁我国人民的身心健康，而且还带来巨大的经济负担。研究HBV，寻找能彻底治疗慢乙肝的治疗方法一直是我国传染病学领域的重大攻关课题。

慢乙肝的难治性与HBV复制的特殊性密切相关，乙肝病毒进入肝细胞后，在肝细胞浆内脱去核衣壳，松弛环状DNA(relaxed circular virus DNA，RC-DNA)进入肝细胞核内，在酶的作用下，将短链补齐，即成为共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)。病毒以cccDNA为摸板，在细胞浆中合成含有HBV全部遗传信息的前基因组RNA和分子量不同的mRNA，再以前者为摸板先后合成HBV的正、负HBV链(Rc DNA)，并翻译各种病毒的结构蛋白，最后在胞浆的内质网内组装病毒，从而完成整个病毒的复制。在细胞浆中复制的新Rc DNA一方面可以合成新的乙肝病毒，另一方面可又进入细胞核，形成新的cccDNA。所以cccDNA有两个来源，一个是来源于血浆中的乙肝病毒，一个是来源于自身复制出来的Rc DNA。现有的抗病毒药物均是通过抑制或影响HBV DNA的合成而发挥其抗病毒作用，对HBVcccDNA作用极少，一旦停止治疗，HBV很快又以cccDNA为摸板开始病毒DNA的复制，造成肝细胞的持续炎症损伤，导致肝炎、肝硬化的发生。所以肝细胞核内一个稳定的cccDNA分子池是HBV持续复制、感染肝细胞的根源，cccDNA的问题是解决慢乙肝治疗的关键之所在，也是近年来乙型肝炎病毒研究的热点。

乙型肝炎治疗终点的选择还很困难，长期用药不仅费用昂贵，还会诱发病毒变异导致耐药等问题。目前，临床一般以HBV DNA小于10³拷贝/毫升、ALT恢复正常和HBeAg血清学转换为判断抗病毒治疗有效的标准，但是停药后大多数患者病情在1年内复发。因此，上述指标不是判断抗病毒治疗应答及安全停药的理想指标。研究发现，在抗病毒治疗结束时，持久应答者肝内cccDNA显著低于非持久应答者，而外周血HBV DNA水平在持久应答者与非持久应答者间无明显差异。以log cccDNA降到-0.8每个肝细胞为抗病毒治疗停药指征，其预测持久应答的敏感性为73％，特异性为78％，阳性率为56％，准确率为77％。以上结果提示，肝组织内cccDNA的含量与抗病毒治疗远期疗效密切相关，对于抗病毒治疗远期疗效的预测优于血清HBV DNA，有望成为判断慢性乙型肝炎抗病毒治疗终点的指标之一。cccDNA的检测除了可以指导抗病毒治疗，对病情的诊断也有参考意义，有学者在肝炎活动的慢乙肝患者外周血中检测到cccDNA，其与ALT的升高具有明显相关性，且早于ALT升高，因而，cccDNA可以作为乙型肝炎肝损伤的早期标志。

要研究HBV cccDNA，首先必须掌握检测cccDNA的方法。由于cccDNA与Rc DNA的主要区别在它是完整的双链环状DNA，而后者的环有部分的缺失，而且平均每个被感染的肝细胞内仅含有10-25拷贝cccDNA分子，因此检测cccDNA具有一定的难度。以前对细胞内cccDNA的了解不多也就是因为缺少特异的检测手段。传统cccDNA检测方法为Souther blot法，操作繁琐，敏感性低，且不能准确定量，故难以在临床上应用。近20年来，由于PCR技术的出现和发展，我们可以通过针对Rc DNA缺少的核苷酸序列设计引物，从而达到特异扩增cccDNA的目的。目前cccDNA定量检测方法的研究在国外及香港开展得较多，但国内报道不多。本发明人一直从事上述方法的研究，曾发表过cccDNA定量检测方法的文章，但该方法的灵敏度不是很高，只有10³-10⁹拷贝/毫升，且序列标本DNA需要量为10ng/ml。

发明内容

针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种乙型肝炎病毒cccDNA荧光定量检测方法，稳定性好、灵敏度高以了解乙型肝炎病毒的复制情况，指导慢乙肝治疗方案的制定，评估抗病毒药物的疗效和判定抗病毒治疗的终点，以期实现cccDNA定量检测的临床应用。