[发明专利]一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用

权利要求书

1、一种从痰中提取细菌核酸的试剂盒，它的组成为：1)痰液化试剂，2)含有固体颗粒的缓冲液；

所述痰液化试剂为N-乙酰-L-半胱氨酸、NaOH或硫苏糖醇中的至少一种；

所述固体颗粒不溶于水且不与核酸发生反应，大小为100-1500μm。

2、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液为10-50mM的Tris.HCl缓冲液；优选为10mM的Tris.HCl缓冲液。

3、根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述固体颗粒为玻璃珠或磁珠。

4、根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述玻璃珠为两种直径大小不同的玻璃珠混合物；所述大玻璃珠的直径为500-1500μm，小玻璃珠的直径为100-300μm。

5、根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：所述大玻璃珠和小玻璃珠的质量比为1∶0.5-1∶10。

6、根据权利要求1-5中任一所述的试剂盒，其特征在于：所述细菌为分枝杆菌。

7、一种利用权利要求1-6中任一所述的试剂盒从痰中提取细菌核酸的方法，包括以下步骤：(a)利用所述痰液化试剂对痰样品进行液化处理后，再与所述含有固体颗粒的缓冲液混合，制备裂解物溶液；(b)灭活裂解物溶液中的杂质和抑制剂，分离得到细菌核酸。

8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述细菌为分枝杆菌。

9、一种鉴定痰液中分枝杆菌菌种的试剂盒，它的组成为：1)权利要求1-6中任一所述的试剂盒；2)分枝杆菌核酸PCR扩增试剂；3)固定有质控探针和分枝杆菌菌种特异探针的芯片；

所述分枝杆菌核酸PCR扩增试剂包括分枝杆菌16S rDNA基因特异性引物对，其核苷酸序列如序列表中序列序列1-4；

所述分枝杆菌菌种特异探针选自下述探针组中的至少一种：结核分枝杆菌复合群特异探针、鸟分枝杆菌特异探针、胞内分枝杆菌特异探针、堪萨斯分枝杆菌特异探针、瘰疬分枝杆菌特异探针、龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌特异探针、偶然分枝杆菌特异探针、戈登分枝杆菌特异探针、耻垢分枝杆菌特异探针、金色分枝杆菌特异探针、土分枝杆菌特异探针、蟾蜍分枝杆菌特异探针、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌特异探针、草分枝杆菌特异探针、不产色分枝杆菌特异探针、浅黄分枝杆菌特异探针和玛尔摩分枝杆菌探针；

所述质控探针包括点样质控探针、杂交质控探针、内对照质控探针和阴性对照质控探针；

所述分枝杆菌选自下述分枝杆菌中的至少一种：结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、龟分枝杆菌或脓肿分枝杆菌、偶然分枝杆菌、戈登分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、金色分枝杆菌、土分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、海分枝杆菌或溃疡分枝杆菌、草分枝杆菌、不产色分枝杆菌、浅黄分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌。

10、根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：所述芯片上还包括空白质控；所述点样质控探针的核苷酸序列如序列表中序列15所示；所述杂交质控探针的核苷酸序列如序列表中序列16所示；所述内对照质控探针的核苷酸序列如序列表中序列18所示；所述阴性对照质控探针的核苷酸序列如序列表中序列17所示。