[发明专利]一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种从痰中提取细菌核酸的方法、试剂盒及其应用。

背景技术

1882年Kock发现结核病的病原菌为结核分枝杆菌，1946年Hinshaw报告首次用链霉素(SM)治疗100例结核病人，开创了结核病诊断、治疗的新时代。经过100多年的努力，人们对结核病的发病、传播、预防、诊断、治疗及预后已有一套完整的经验。在美国及其它工业发达国家，1953年-1985年结核病以每年5.8-10％的速度下降，美国医学界曾一度乐观地认为，可以预防和治疗的结核病将成为美国历史中的一幕，不再成为公共卫生问题，并认为到2000年可以控制结核病的传播，21世纪初即可消灭结核病。

由于人们盲目乐观于结核病即将消灭，转移了结核病控制的注意力和资金；由于医生和病人对结核病认知的片面性，造成滥用药；人类免疫缺陷病毒(HIV)感染、器官移植、免疫抑制剂的使用等导致免疫损害宿主(ICH)增多；以及高龄人口机体免疫力下降，使结核病的发病率再次回升，成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。多种抗结核药物耐药菌株(MDR)的产生与传播，使结核分枝杆菌感染难以控制，再度发展为难治倾向。据世界卫生组织(WHO)提供的数据，2002年世界结核病的形势为：感染人数约20亿，新发结核病例880万，其中，新涂阳结核病例390万，发病率比2001年增长1.1％，新发病例中耐多药比例为3.2％，结核病的死亡人数达180万。由于耐药结核杆菌的流行，使结核病成为由单一微生物导致死亡的主要原因，占世界人口死亡数的7％，占可预防死亡数的26％。

非结核分枝杆菌(NTM)引发的肺部疾病越来越为人们所关注，人类对非结核分枝杆菌引发的疾病的研究与认识，随着时间的推移逐渐深入。1950年以前，非结核分枝杆菌病仅有散在的病例报告；1950-1970年，人们研究了非结核分枝杆菌病的组织学与诊断标准；1970年以后，人们提出了非结核分枝杆菌的分类与鉴定方法。但这些方法的特异性较差，难以区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌。非结核分枝杆菌引起的肺部病无论在临床症状、胸部X射线病灶、PPD皮试检查、甚至抗酸染色性质上，与肺结核均很类似，因而在临床上容易出现误诊。非结核分枝杆菌引起的肺部病与肺结核的治疗方法不同，大多数非结核分枝杆菌对抗结核药物呈天然的抗药性，因而，在临床上一线抗结核药物对非结核分枝杆菌引起的肺部病疗效差，甚至造成治疗失败。应及时进行分枝杆菌菌种鉴定，及早确定是何种分枝杆菌引起的感染，以便采取相应的治疗方案。

痰液中结核杆菌检测具有重要的意义。首先，痰液中结核杆菌检测是诊断肺结核的主要依据。由于肺结核的早期症状很容易和感冒、支气管炎等上呼吸道疾病相混淆，因此疑似肺结核病除了要进行X线胸透、摄片检查外，还必须进行痰液检查，医生将根据痰液检查结果制定合理的治疗方案。其次，痰液中结核杆菌检查是治疗过程中治疗方案转换的重要依据。目前主要的治疗肺结核的方法为分阶段联合用药，即在治疗开始的强化期用4-5种药物进行治疗，以尽快杀灭大量的结核菌，控制传染源，阻断病原菌传播；然后将药物减少到2-3种进行巩固疗效。大多数病人经过2个月的强化期治疗后，病灶会明显好转，症状减轻甚至消失，但这时结核杆菌不一定被全部消灭，在结核杆菌尚未完全转阴的情况下就进入巩固期治疗，容易引起结核杆菌死灰复燃，甚至造成耐药的严重后果。因此在治疗满2个月时，检查痰液中的结核杆菌及其耐药性尤为重要。

目前常用的结核杆菌细菌学检查方法如下：

(1)痰涂片镜检法，该方法是世界范围内普遍使用的最基本的结核杆菌检查方法。其特点是简单、快速、价廉、当天出结果；但无法辨别死菌活菌，敏感性低，通常需5000-10000条菌/ml痰才能够得到阳性结果；特异性差，各种抗酸杆菌均可着色，需要通过进一步试验才能确定是否为结核杆菌。

(2)痰结核杆菌常规培养法，该方法是鉴定死菌活菌的可靠方法，被誉为“黄金标准”。其缺点是培养时间长，需2到4周才能出结果，而且敏感性低，涂片阳性标本只有约80％培养阳性；特异性差，各种分枝杆菌均可生长，需结合药物敏感性试验和分枝杆菌菌种鉴定才能确定是否为结核杆菌。

(3)药物敏感性试验，用于鉴定结核杆菌对抗菌素结核药物的敏感性水平。这项试验通常是在痰结核杆菌培养的基础上进行的，故所需时更长。

(4)分枝杆菌菌种鉴定，根据不同分枝杆菌的理化特性，可以精确地鉴定出分枝杆菌的菌种，但操作复杂，且个别试验使用的药品有一定的危险性。