[发明专利]CpTI酶联免疫检测试剂盒、其制备方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)酶联免疫检测试剂盒，本发明还涉及制备该试剂盒的方法。

背景技术

害虫是危害我国农业生产的主要限制因素，大量化学农药的使用 不但污染环境，而且也使得有益昆虫的数量锐减，害虫的抗药性不断 加强。此外，化学杀虫剂使用后的农药残留对人畜都会有严重的危害。 因而转基因植物抗虫工程成为科学家的研究热点领域之一。

豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea proteinase Trypsin Inhibitor，CpTI) 是对靶标昆虫毒杀效果最好的蛋白酶抑制剂之一，通常能专一地与某 一类消化酶结合，影响昆虫的消化作用，同时引起昆虫体内蛋白酶产生， 造成必需氨基酸亏空，破坏其正常生理功能，而导致昆虫发育受阻或死 亡。另外它们还可以引起昆虫体内水分平衡失调，影响酶的调节及昆 虫蜕皮。自Hilder等(1987)首次获得转CpTI基因烟草以来，蛋白 酶抑制剂在抗虫植物基因工程中的应用已有十余年，很多其他作物如 稻、甘蓝、马铃薯、青椒、苜蓿、油菜、蕃茄都得到了转蛋白酶抑制 剂基因的植株或品系。与此同时，科学家们还将CpTI基因进行修饰 并与Bt杀虫蛋白基因进行共转化转入棉花获得双价复合性状的抗棉 铃虫棉花如SGK321，转入水稻获得双价抗螟虫水稻如科丰6号等， 这些转CpTI基因作物对靶标害虫具有良好的抗虫效果，同时也拓展 了转基因作物的抗虫谱，对延缓靶标害虫抗性上升具有重要的作用。

转CpTI基因作物对靶标昆虫具有控制作用关键在于植物能够持 续表达CpTI蛋白，所以外源杀虫蛋白的含量对于评价转基因作物的 抗虫效果是至关重要的，另外，转CpTI基因作物的生态安全性也引 起国际上极大的关注，转基因作物及其后续加工产品中CpTI含量的 精准测定方法对于转基因生物安全管理具有保驾护航的支撑作用。虽 然，我国转CpTI基因抗虫作物发展迅速，但仍然缺乏精准和快速的 检测与评价技术。

转基因植物及其产品中表达产物的检测方法主要在外源表达产 物水平上进行。即在翻译水平上对特异性蛋白质的检测，主要包括酶 学反应检测法和免疫学检测法，和生物活性检测法。目前对于胰蛋白 酶抑制剂如CpTI含量或在转基因作物及其产品中表达水平的检测方 法也主要采用上述检测方法的一种或3种方法的整合。即室内靶标昆 虫的生物活性测定、酶抑制剂抑制活力检测和通过蛋白质与特异性抗 体结合进行检测如酶联免疫(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay， ELISA)法测定。室内靶标昆虫的生物活性测定持续周期较长，易受 环境因素的影响，对于不同时期的样品很难比较，同时不同时期供试 靶标昆虫种群也存在差异，给检测结果的判定带来一定的困难，然而 生物测定法是最能够反映转基因植物抗虫效果的方法。酶抑制法测定 简单，其原理是依据蛋白酶抑制剂对目标蛋白酶具有抑制作用通过底 物反应检测剩余蛋白酶的活力来间接测定蛋白酶抑制剂的含量。但蛋 白酶酶抑制法进行定量测定时，会受到来自植物本身的干扰。一方面， 一些植物自身或多或少天然存在蛋白酶抑制剂对检测结果产生干扰； 另一方面特别当转基因植物中抑制剂的含量非常低时，植物本底颜色 往往会对底物反应产生的颜色在吸光值因素有一定的干扰。所以，酶 抑制法往往很不准确。目前，特异性荧光酶抑制法逐渐发展起来，在 一定程度上降低了传统酶抑制法的不足。酶联免疫法测定法测定简 单，准确，快速，但需要纯化抑制剂，制备特异的抗体，完成这些工 作在前期需要花费大量的时间，人力和物力。当前，有关豇豆胰蛋白 酶抑制剂或转基因植物及其产品中CpTI杀虫蛋白表达免疫检测的报 道很少，国内有关豇豆胰蛋白酶抑制剂或转基因植物及其产品中 CpTI表达情况多数限于DNA或mRNA的检测，核酸水平的检测可 能存在假阳性的结果而且基因的导入并不一定代表功能蛋白的表达， 表达含量也为未可知，没有蛋白表达的直接证明。有关蛋白检测表达 的检测也只有酶抑制剂方法和极少的免疫学检测而且在这个层次上 报道的结果与田间实际抗虫效率相差甚远，假阳性很高终不尽人意。 因此，为了更好的评价豇豆胰蛋白酶抑制剂及研究转胰蛋白酶抑制剂 基因作物的生态安全性、食品安全性，迫切需要制备特异性抗体并建 立相应精准和快速的检测的豇豆胰蛋白酶抑制剂酶联免疫检测方法。

发明内容