[发明专利]提取、纯化靶核酸的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程领域中的核酸的提取和纯化方法及其应用，特别是涉及通过捕获样品中的靶核酸，对靶核酸进行提取、纯化的方法及其在核酸检测中的应用。 

背景技术

近几年，由于核酸检测市场的巨大需求，国内外在这方面都进行了深入研究。现有的检测技术大多只针对样品中特定的核酸片段进行直接检测或放大检测，并需要对核酸片段进行提纯。目前，核酸的提取方法很多，如SDS法、CTAB法、离心柱法和酚-氯仿抽提法等，由于这些方法不是以特异性捕获目的核酸为目的，所以提取的产物常常是样品中的总RNA或总DNA或两者的混合，其中，大部分为非目的核酸。这些非目的核酸的存在往往会在后续的核酸检测中产生干扰作用，如在PCR、NASBA或TMA操作中出现非特异性扩增等，因此必须对提取产物增加纯化的措施，操作自然比较繁琐。 

为了解决上述在核酸检测中存在的问题，科研人员进行了一系列特异性捕获目的核酸的研究。如国内朱永芳等人(CN152129A)发明了一种利用共价结合在PCR管壁上的捕获核酸将目的核酸直接吸附到PCR管壁上的方法。但是，将捕获核酸直接结合到管壁上需要复杂的化学反应步骤，且所用的PCR管壁也必须经过特殊处理。所以该方法成本高，操作复杂。另一方面，由于核酸在固相表面的杂交效率远远低于液相杂交效率，即使是对分子较小的靶核酸样品，其捕获效率也很低。而当被杂交分子的分子量较大的时候(如大于140bp)，固相杂交的捕获效率则更低。尽管如此，该发明提出的在一个PCR管中完成从核酸提取到检测整个过程的方法，仍具有先进性。国外Lisen等人(美国专利号6280945)和国内周科隆等人(CN1940087A)提出了一种通过利用Strepavidin(链亲和素)和Biotin(生物素)将捕获探针预先结合到固相载体上进行特异核酸提取的方法，此法虽然操作较固相载体共价结合捕获探针(CN1521269A)简单，但这两个专利提出的都是利用同一类型的寡核苷酸作为反应体系的捕获探针，没有考虑到同一类型的捕获探针对不同类型的靶核酸的捕获效率是存在很大差异的(Nucleic Acid Research(1998)Vol.26(9)2224-2229；Nucleic Acid Research(2004)Vol.32(9)e72)。他们提出的方法用于从同一样品中提取一种类型的靶核酸(如只提取DNA或RNA靶标，不同时提取RNA和DNA)是行得通的，但 如果将其用于从同一样品中同时提取RNA和DNA靶标时，这些方法就行不通了。这是因为在同一反应体系中，形成RNA、DNA杂交双链和形成DNA、DNA双链的动力学行为是不同的(参考文献：Nucleic Acid Research(1998)Vol.26(9)2224-2229)。所以，在同一系统中用单一类型的捕获探针来捕获不同类型的核酸(RNA和DNA)的捕获效率也是不同的。优化缓冲或反应体系的结果也只能是要么对捕获DNA有利，要么对捕获RNA有利，无法同时兼顾对DNA和RNA靶标的同步高效率提取，因而在某些需要从同一样品中同时以极高灵敏度和极高效率提取RNA和DNA靶标的领域中(如在血液筛查领域，需要从同一样品中同步高效率提取RNA(HIV和HCV)和DNA(HBV))，这些方法就存在非常严重的缺陷。 

正因如此，迄今为止，美国FDA批准的血液筛查产品没有一个体系是可以同时提取RNA和DNA靶标的。FDA批准的罗氏的血液筛查产品是利用不同方法捕获RNA(HCV，HIV)和DNA(HBV)核酸并分开检测。FDA批准的另一家Gen-Probe公司的血液筛查产品(Procleix)虽可同时检测HCV和HIV，但这两者均为RNA病毒，DNA病毒(HBV)并不包含其中。也正是因为同样的原因，国内周科隆等人(CN1940087A)提出的用DNA捕获探针同时捕获RNA(HIV和HCV)及DNA(HBV)的方法在血液筛查中的应用是很难行得通的，即便勉强可行，其捕获效率和检测灵敏度也很低。事实上，CN1940087A提出的方法只可用于提取DNA靶标(HBV)，对RNA靶标(HIV和HCV)的提取效率是很低的。因此，以上技术和发明在灵敏度要求高，且同时需要高效率提取RNA和DNA靶标的血液筛查和食品安全等领域中都不合适，市场迫切需要一种可以从同一样品中同时高效率提取RNA和DNA靶标的方法。 

发明内容

本发明的目的是提供一种可以从同一样品中同时以高效率提取、纯化靶核酸(以RNA和/或DNA为靶标)的方法。