[发明专利]核酸恒温同步放大检测方法及其应用

权利要求书

1.核酸的恒温同步放大检测方法，包括以下步骤：

1)将含有下列组分的反应物混合：

a.待测核酸样品；

b.引物1：该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；

c.引物2：该引物可与待测核酸样品负链的5’端杂交；

d.选自分子信标、荧光共振、蝎子探针和分子火炬中的一种或多种荧光探针；

e.RNA依赖的DNA聚合酶；

f.至少一种可以识别所述启动子序列的RNA聚合酶；

2)将反应物混合后，在密闭容器中进行恒温放大反应，并用检测仪同步检测反应体系中荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对样品进行定量或定性检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的待测核酸样品为RNA或DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的启动子序列为T7启动子序列、T3启动子序列、M13启动子序列或SP6启动子序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的所述RNA依赖的DNA聚合酶为MMLV逆转录酶或AMV逆转录酶。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的RNA聚合酶为T7、T3、M13或SP6 RNA聚合酶。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的荧光探针为分子信标，所述RNA依赖的DNA聚合酶为MMLV逆转录酶，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的反应物分为第一阶段反应物和第二阶段酶反应物，所述第一阶段反应物中还包含有Tris、KCl、MgCl₂、NTPS、dNTPs、甘油和DMSO，所述第一阶段反应物的组分具体为：10-50mM Tris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mM NTPS，0.1-10mMdNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.1-2μM引物1，0.1-2μM引物2，0.1-2μM荧光探针；所述第二阶段酶反应物中还包含有Tris、Triton X-100、KCl、EDTA、DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体为：100-9000U RNA依赖的DNA聚合酶，100-5000U RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％ Triton X-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中的恒温放大反应条件为：先将第一阶段反应物充分混合，在55-90℃下温育2-30分钟后，再在42-55℃下温育2-30分钟，在此过程中加入第二阶段酶反应物，由此开始在42-55℃下继续温育30-120分钟，用检测仪同步记录荧光信号的变化，根据荧光信号产生的时间和强度对待测样品进行定量或定性检测；所述第一阶段反应物与第二阶段酶反应物的体积比为1-50∶1。

9.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述检测仪为AB17000、7300、7500、7700、7900系列，Stratagen MPX3000系列或Barad iQ系列。

10.一种核酸恒温同步放大检测试剂盒，包括以下作为反应物的组分：

a.待测核酸样品；

b.引物1：该引物的3’端可与待测核酸样品的3’端或靠近3’端处杂交，5’端为启动子序列；

c.引物2：该引物可与待测核酸样品负(-)链的3’端杂交；

d.选自分子信标、荧光共振、蝎子探针和分子火炬中的一种或多种荧光探针；

e.MMLV逆转录酶和AMV逆转录酶中至少一种RNA依赖的DNA聚合酶；

f.至少一种可以识别T7、T3、M13或SP6中所述启动子序列的RNA聚合酶。

11.根据权利要求10所述的试剂盒，其特征在于：所述反应物组分分为第一阶段反应物和第二阶段酶反应物，所述第一阶段反应物中还包含有Tris、KCl、MgCl₂、NTPS、dNTPs、甘油和DMSO，所述第一阶段反应物的组分具体为：10-50mMTris，20-90mM KCl，10-50mM MgCl₂，0.1-10mM NTPS，0.1-10mM dNTPs，5-40％甘油，0-25％DMSO，0.1-2μM权利要求1所述引物1，0.1-2μM权利要求1所述引物2，0.1-2μM分子信标；所述第二阶段酶反应物中还包含有Tris、Triton X-100、KCl、EDTA、DTT和甘油，所述第二阶段酶反应物的组分具体为：100-9000UMMLV逆转录酶，100-5000U T7 RNA聚合酶，20-100mM Tris，0.1-1％Triton X-100，30-300mM KCl，0.01-0.5mM EDTA，0.1-2mM DTT，20-50％甘油。