[发明专利]核酸恒温同步放大检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体涉及将核酸的恒温放大与检测同步进行的检验方法，及其在临床检验、血液筛查、食品安全检查及环境监测中的核酸检测中的应用。

背景技术

在核酸检测过程中，多数情况下样品中的核酸含量较低，为了使检测达到一定的灵敏度和准确度，需要对样品中的待检核酸片段进行扩增。1985年，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，简称PCR)技术的产生推动了核酸检测技术的发展，该技术已成为核酸检测技术中的重要手段。随后，又衍生出诸如逆转录酶-聚合酶链反应(Reverse Transcriptase-PCR，简称RT-PCR)、实时荧光定量聚合酶链反应(RealTime Fluorescent Quantified PCR，Real-time FQ PCR)，基于转录的扩增(Transcription Mediated Amplification，TMA)，Nucleic Acid Sequence BasedAmplification(NASBA)等一系列核酸扩增检测方法，均可用于DNA样品或RNA样品的扩增及定性、定量检测中。目前，除实时荧光定量PCR外，其余的核酸检测方法都是采用“基因扩增+扩增子检测”的操作模式。目前，终点PCR或终点TMA/NASBA检测方法还被广泛应用。由于这些方法在实际应用中易引起扩增物的污染，因此常造成实验结果的假阳性或假阴性现象，从而使得该技术的实际应用尤其是临床检测具有很大的局限性。实时荧光定量PCR虽然在技术上解决了上述难题，但设备昂贵、操作复杂，阻碍了其在发展中国家的大规模推广使用。

1991年，Compton发明了基于核酸序列的扩增技术(Nucleic Acid Sequence BasedAmplification，简称NASBA)(Nature，350(6313)：91-2，1991)。该技术是以RNA分子的逆转录-转录为技术主线，无需进行类似于PCR过程的温度循环，可在恒定的温度下，短时间内进行RNA扩增。但扩增产物常采用电泳、探针杂交、点杂交或化学发光等方法来完成定性检测。此外，Gen-Probe公司也发明了与基于核酸序列扩增原理完全类似的转录介导的扩增技术(Transcript ion Mediated Amplification简称TMA)(Journal of clinical Microbiology，35(3)，676-8，1997)，其与NASBA的核酸扩增方法几乎完全相同，只不过用MMLV逆转录酶替代AMV逆转录酶。TMA的扩增结果是通过杂交保护测定(Hybridization Protection Assay，简称HPA)技术进行定性检测的。其它恒温扩增技术，如链置换扩增(SDA)、基于螺旋酶的扩增(HDA)等都是类似的等温扩增技术，这些技术所需的酶成本高昂，引物设计复杂，技术要求更高，相对应的，其反应检测成本也很高。

因此，在目前的实验室研究及临床检测中所使用的核酸定量扩增检测方法主要以实时荧光定量PCR为主。该方法是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个反应进程，最后通过标准曲线进行定量分析。其荧光检测模式分为TaqMan荧光探针、TaqMan MGB荧光探针(在荧光探针分子3’端连接非荧光淬灭剂及MGB基团(Minor Groove Binder)，亦称为MGB探针)、SYBR Green荧光染料、分子信标(Molecular Beacon)探针和荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance EnergyTransfer，简称FRET)探针等.虽然实时荧光定量PCR方法的灵敏度和准确度较高，但检测成本相对昂贵，且检测过程还需依赖特殊设备，因此，该技术在操作方法和检测成本上都有很大的局限性.如果待测样品是RNA，还需将其利用反转录技术转变成cDNA才能进行后续的PCR反应，其试剂成本、技术要求和检测时间等都大大地提高或延长，灵敏度也不如DNA样本检测高.所以，RT-PCR虽然是目前最常见的用于RNA样本检测的技术，但大规模检测的推广困难很大.