[发明专利]一种预测血栓形成性疾病发生风险的试剂盒、方法及用途

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种预测血栓形成性疾病发生风险的检测试剂盒、方法和用途。更具体的，本发明涉及通过聚合酶链式反应方法，提供一种分析编码凝血酶原基因和凝血因子V的多态性位点的试剂盒、方法和用途。

背景技术

先天性血栓性疾病也称遗传性血栓形成倾向，是由于凝血，抗凝和纤溶系统某个环节的特异性障碍而引起的一类疾病，以复发性静脉血栓为主要临床表现，大多属先天遗传性，常首发于青少年时期。据西欧部分地区统计，发病率在20/100000以上，超出先天性出血性疾病。

继发于一些疾病的高凝状态和血栓形成与原发于凝血、抗凝血机理缺陷的先天性血栓性疾病不同，常表现为止血，抗血栓机理非特异性，多环节的变化，病因多数是复合性的。生理或一些体外的因素也可导致高凝状态，如高龄、妊娠、产后、剧烈运动、情绪激动、寒冷、吸烟、高脂饮食、药物(口服避孕药)等。不少内科疾病引起的高凝状态和血栓形成包括：①肿瘤；②自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、溃疡性结肠炎，Behcet综合征；③内分泌及代谢性疾病：糖尿病、肾上腺皮质功能亢进；④肾脏疾病：肾病综合征；⑤肝脏疾病；⑥心、脑血管疾病：心绞痛、心肌梗塞、脑血栓、脑栓塞、短暂性脑缺血、闭塞性脉管炎，原发性高血压；⑦血液病：弥散性血管内凝血、血栓性血小板减少性紫癜、夜间阵发性血红蛋白尿、骨髓增生综合征；⑧肺部疾病：肺栓塞、慢性阻塞性肺炎、成人呼吸困难综合征；⑨高粘血症：白血病、红细胞增多症镰形红细胞病、高免疫球蛋白血症；⑩高脂血症。

静脉血栓形成(venous thrombosis，VT)在发达国家年发病率1‰，且随年龄增长呈递增现象。儿童的发病率1/10万，老年人接近1％。静脉血栓形成多发生在下肢深静脉，与其相关的主要并发症是血栓后遗综合征及致死性的肺动脉栓塞，发生率分别是20％及1％～2％。我国尚缺乏大规模血栓流行病学的调查资料。从近些年我科收治的病人来看，静脉血栓形成是常见病、多发病。研究证明，凝血因子的基因多态性与血栓形成密切相关。静脉血栓是一种多因子疾病，既有遗传因素，又有后天获得的一些危险因素。因子V和因子II(凝血酶原)是两种最常见的影响家族性血栓形成倾向的因子，家族性血栓形成倾向是一种威胁健康甚至造成死亡的疾病。用常规临床检测方法通常很难发现静脉血栓，但是，对于有家族史以及有其他严重疾病的患者，通过遗传预置筛查检测有关致病因子，可能是预防这类疾病的一种合适途径。

凝血酶原基因(F2)定位于人类第11号染色体(11p1-q12)短臂上，其编码的蛋白在应对伤害的凝血过程中发挥着重要的作用。F2编码的蛋白凝血酶原在凝血因子X和凝血因子V、磷酸酯以及钙离子的激活作用下转化成凝血酶并且帮助引发凝血链级反应。

凝血酶原基因最常见的突变发生在3′未翻译端区域，具体的位置是碱基对20210的碱基G→A的置换。这一突变增加了F2 mRNA转录翻译的效率，其结果就是凝血酶原转录数量的增加，而这将有利于功能性凝血酶原蛋白的翻译表达，最终会导致高凝状态。凝血酶原(20210G→A)的突变不论是杂合子和纯合子均表现为半显性，会导致静脉栓塞的发生以及复发的风险的增加。由凝血酶原(20210G→A)杂合突变在没有其他先天遗传易感因素或者后天的环境易感因素的条件下导致的静脉栓塞的相对危险度是非突变体的2-4倍。

凝血因子V(F V)是一单链糖蛋白，分子量为330kD，主要在肝脏合成。F V基因定位于染色体1q23，长约80kb，有25个外显子，其cDNA长6672bp，编码含2224个氨基酸的蛋白质。研究表明，F V基因第10号外显子第1691位上的G→A可引起高凝状态。此点突变使F V蛋白分子第506位的精氨酸变成了谷氨酰胺(Arg→Gln)，这种突变的蛋白分子称为FV Q506或FV Leiden突变，该突变影响了蛋白C系统的抗凝功能。上面提到506位Arg是APC灭活FV的第一个切割位点。Arg506→Gln导致APC灭活FV延长，这一结果使得FV对外源性APC产生抵抗而使APTT不能延长。同时，突变的FV仍保持促凝活性，以及它灭活的延长使得凝血酶形成速度加快，凝血酶的增加又反馈性激活FV、F VIII使得凝血与抗凝血平衡失调导致高凝状态形成。

FV Leiden突变，使得凝血酶形成增加，抑制了纤溶过程，这表明FV Leiden突变的患者不仅比正常人易形成血栓，且形成后血栓不易被溶解。FV Leiden突变在欧洲人口中比例2～7％。VT病人中占20～50％。FV Leiden突变杂合子发生血栓的相对危险性是正常人的7倍，而纯合子高达80倍。