[发明专利]检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒的检测方法，尤其涉及一种检测禽流感病毒的胶体金免 疫渗滤增敏方法及其试剂盒。

背景技术

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽类的一种从呼吸 病到严重败血症等多种症状的急性高致病性传染病。除了禽类，A型流感病毒还 感染其他种属的动物，如马、猪等，1997年首次发现高致病性禽流感H5N1可 感染人类。自禽流感于1878年在意大利发现以来，给养鸡业造成巨大的经济损 失。历史上危害最大，经济损失最严重的一次禽流感(H5N1)爆发于1983年美 国滨州地区，美国政府为此共花费了6000多万美元，间接经济损失估计达3.48 亿美元。我国香港地区近期爆发的禽流感，据估计损失约达8000万港币。1997 年及2003年在香港H5N1禽流感已干扰18人，4人死亡，2003年年底开始该病 毒在亚洲国家已造成上百人感染，几十人死亡。2006年2月以来，禽流感疫情 愈演愈烈，马来西亚、俄罗斯、中国、波黑、罗马尼亚、法国、印度、埃及、德 国、奥地利、伊朗、希腊、斯洛文尼亚、意大利等国相继报道了禽流感疫情。因 此对禽流感病毒简便、快捷、高灵敏度、高特异性的检测成为控制禽流感疫情扩 散的当务之急。

现有禽流感病毒检测方法主要分为抗体检测及抗原检测方法。抗体检测方法 包括：血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition，HI)、琼脂免疫扩散试验 (Agarose gel immunodiffusion，AGID)、酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)、补体结合试验(Complement Fixation Assays，CF)、 神经氨酸酶抑制试验(Neuraminidase inhibitor test，NIT)以及病毒中和试验(Virus neutralization Test，VNT)等。由于抗体检测方法不能区分人工注射疫苗和病毒感 染因而对动物检疫缺乏实际应用意义。因此，目前禽流感病毒检测主要为抗原检 测方法，相对快速的方法为ELISA和荧光RT-PCR，但这两种方法在大范围应用 中存在以下缺陷：(1)需要昂贵的仪器设备，检测成本较高且不易在基层单位推 广；(2)所有这些技术方法都不能在基层生产场、检疫站和临床等现场使用，必 须有专门的实验室；(3)操作较繁琐，检测时间均在数小时以上，直接影响了疫 情的防控速度。

由于胶体金颗粒对许多蛋白质都有很强的吸附功作用，可与SPA、IgG、毒 素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质非共价结合，从而使其成为免疫反应 的优良标记物，并使得固相膜免疫测定技术(Solid Phase Membrane-based Immunoassay)更加简便。常用的固相膜为硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜。 斑点免疫测定法(Dot-Immunoboding Assay，DIBA)是在免疫印迹技术基础上改 良发展起来的一项技术。由于其敏感性、特异性与酶联免疫测定法(ELISA)相 当，且操作简单、快速而发展为不同的方法。其中包括斑点免疫渗滤测定法(Dot Immuno Filtration Assay，DIFA)和斑点免疫层析测定法(Dot Immuno Chromatographic Assay，DICA)。以胶体金为标记物的斑点免疫渗滤测定法称为 胶体金免疫渗滤测定法(Dot-Immunogold FiltrationAssay，DIGFA)。然而，上述 几种方法检测禽流感病毒难以满足高灵敏度的要求。以往人们主要利用银染色技 术来提高DIGFA的检测灵敏度。然而，该技术的缺点是背景模糊，增敏效果相 对不强，因而限制了其应用范围。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏方法及其 试剂盒。本发明是在胶体金斑点免疫渗滤测定法(双抗体夹心)的基础上，采用 纳米金颗粒增敏技术，能显著提高检测禽流感病毒的灵敏度，具有敏感、快速和 特异性好等特点，并且价格低廉，能进行样品的高通量筛查，适用于基层或现场 检测禽流感病毒，从而克服了目前胶体金免疫渗滤测定法(DIGFA)检测灵敏度 不高的问题。

本发明检测禽流感病毒的胶体金免疫渗滤增敏测定方法，步骤如下：

1.制备免疫渗滤试纸条

免疫渗滤试纸条为A或B之一；