[发明专利]胚胎干细胞样多能性细胞及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域。更具体地说，本发明涉及一种诱导体细胞产生胚胎干细胞(ES)样多能性细胞的方法、利用该方法获得的ES样多能性细胞及其用途。

背景技术

胚胎干细胞一直是各国科学家研究的热点，因为这种细胞具有形成完整个体的分化潜能，可以无限增殖并形成全身两百多种细胞，随着研究的深入，其有可能形成机体的组织和器官，并有可能应用到临床医学，为人类带来福音，另外在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、治疗性克隆和发育生物学等的研究应用中起着重要的作用。但是胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团或胚胎外胚层经体外抑制分化培养分离得到的多能性细胞，从而引发了胚胎相关实验的伦理道德问题。特别是在宗教信仰的国家，限制了胚胎干细胞的研究。

为了避免伦理道德的问题，科学家们一直在尝试不用破坏胚胎来建立胚胎干细胞系，目前常用的方法有两种，一种是利用细胞融合技术，把体细胞和干细胞相融合以获得具有干细胞潜能的融合细胞，不过得到的是四倍体，这个问题一直没有得到解决；另一种方法是目前在生命科学引起轰动，被誉为人类生命科学新的里程碑的技术，即利用几种因子转染成纤维细胞诱导而成的多能性干细胞。但是这几种因子中有原癌基因，另外所使用的是病毒转染，所获得的干细胞的安全性是个巨大的问题，所以离临床应用还有一定的距离。

除了多能性基因诱导、核移植、细胞融合外，利用细胞或者组织的提取物同样可以对细胞进行重编程。利用SLO通透的方法把细胞提取物导入其它细胞，是近年来发展起来的对细胞重编程的一种方法。它是提取一种细胞(靶细胞)的可溶性内容物，并把另外一种细胞用SLO进行膜通透处理，使细胞膜形成较大的孔，然后置于靶细胞的提取物中，使得被处理的细胞内物质能够与提取物中的成分发生交换，从而使提取物中的细胞因子在被处理细胞中发挥作用，使被处理的细胞表达靶细胞的基因，甚至形态和功能也向靶细胞方向改变。目前提取物的研究主要限于不同类型体细胞之间的转换，即用一种类型的体细胞的提取物处理另一种类型的体细胞，使处理的细胞的基因表达向制备提取物的细胞方向转变。

ES细胞作为一种多能性细胞，其对体细胞的重编程能力在融合的细胞中已经得到充分的证实，ES细胞的提取物同样也被检测到具有对体细胞进行重编程的能力。用小鼠的ES细胞处理NIH3T3细胞系后，被处理的细胞形成了类ES的集落，并表达了干细胞的标记基因[Taranger et al.，2005]。但是NIH3T3是永生化的细胞系，很难应用到临床，为了找到一种真正地将体细胞重编程为ES细胞并能应用到临床的可行性方法，本研究首先尝试利用小鼠ES细胞的提取物通过药物通透处理的小鼠成纤维细胞，以探索对正常体细胞进行重编程的方法。结果表明，对正常体细胞膜进行药物通透处理，这种导入ES细胞提取物方法的效率非常低，不能得到满意的效果，无法获得ES细胞样的多能性细胞。

为了克服上述方法的缺点，本发明提出了诱导体细胞产生ES样多能性细胞的方法、以及利用该方法获得的ES样多能性细胞及其用途。其中使用显微注射技术，其是利用显微操作系统将外源的物质直接注入到细胞、卵或胚胎中的方法，显微注射技术可以向细胞中注射多种物质，包括细胞因子、转基因构件、生长因子、药物和染料等。显微注射方法基本上对细胞或胚胎的后续生长和发育没有影响。所以本发明采取了显微注射方法注射ES的提取物到体细胞中，并获得ES样的多能性细胞，这些细胞可以表达ES的特异性的标志性因子和蛋白，并能在体外无限地传代。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种诱导体细胞产生ES样多能性细胞的方法、以及利用该方法获得的ES样多能性细胞及其用途。

本发明通过一种根据下述的诱导体细胞产生ES样多能性细胞的方法、由该方法获得的ES样多能性细胞以及该ES样多能性细胞的用途达到该目的。

本发明的一个方面涉及一种诱导体细胞产生胚胎干细胞(ES)样多能性细胞的方法，包括下述步骤：1)体细胞的制备；2)ES细胞提取物的制备；3)利用该ES细胞提取物处理该体细胞。

优选地，在利用ES细胞提取物处理体细胞的步骤中使用显微注射方法。

优选地，培养的ES细胞经0.05％胰蛋白酶消化离心后，用PBS和Lysis缓冲液洗细胞，再用Lysis缓冲液重悬沉淀，用超声波细胞破碎仪破碎细胞，离心后取上层液体冻存。