[发明专利]一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法。

背景技术

原生质体是指植物细胞中除去细胞壁的裸露部分。利用原生质体进行细胞融合，可以实现远缘遗传重组，创造新的遗传型；可以转移抗逆性状，改良作物品质；可以转移细胞质基因控制的性状。原生质体还可以作为受体进行基因重组和转移，培养优质高产作物新种质，提高植物细胞中次级代谢物质含量。建立稳定高效的原生质体提取体系，是进行原生质体基础理论研究和原生质体培养的关键。

在植物原生质体的提取中，提取的原生质体的产量和活力，与原料来源与生理状态，酶解液的组成成分，酶解方法与条件，收集与纯化方法等有密切关系。现在原生质体提取多采用一步酶解法，其中，对提取效果影响最大的是纤维素酶浓度和酶解时间。若酶液浓度较大，酶解时间就较短；反之，时间就需增长。但若酶浓度过大，就会导致原生质体中毒和原生质体破裂数增多；而酶解时间过长不仅会导致较早游离出的原生质体破裂，且浪费时间。

因为不同的植物，其细胞壁的特性有差异，即使是同一种植物，其不同部位的细胞壁也不相同，因此，探索适于提取同一种，特别是同一属，甚至是同一科的植物的原生质体的方法尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取蔷薇科植物根原生质体的方法。

本发明所提供的提取蔷薇科植物根原生质体的方法，是将蔷薇科植物根先用酶解液I进行酶解，再用酶解液II进行酶解，得到蔷薇科植物根原生质体；所述酶解液I为含有210-420U/ml纤维素酶的溶液，所述酶解液II为含有80-320U/ml纤维素酶和1-4U/ml果胶酶的溶液。

其中，所述酶解液I具体可为含有280U/ml纤维素酶的溶液，所述酶解液II具体可为含有240U/ml纤维素酶和2U/ml果胶酶的溶液。

为了获得较好的提取效果，所述酶解液I和酶解液II均可以用含0.5-4mmol/LCaCl₂，0.5-2mmol/L MgCl₂，0.05-0.25mg/mL牛血清白蛋白，0.022-0.055mg/mL抗坏血酸，0.25-1mg/mL聚乙烯吡咯烷酮的水溶液进行配制。

所述酶解液I和酶解液II具体可用含2mmol/LCaCl₂，1mmol/L MgCl₂，0.05mg/mL牛血清白蛋白，0.044mg/mL抗坏血酸，0.5mg/mL聚乙烯吡咯烷酮的水溶液进行配制。

在本发明方法中，用所述酶解液I和所述酶解液II进行酶解的温度可以为24-26℃，用所述酶解液I进行酶解的时间可以为40-60分钟；用所述酶解液II进行酶解的时间可以为80-120分钟。

所述酶解可以在转速为100-200r/min的震荡条件下进行，旋转半径为50mm或25mm。

为了进一步提高酶解效率，所述蔷薇科植物根在酶解前可以先切成0.5mm-1mm的小段。

所述蔷薇科植物根与所述酶解液I中的所述纤维素酶的配比为(2100-5600)U纤维素酶/g根，优选为(2100-4200)U纤维素酶/g根；所述蔷薇科植物根与所述酶解液II中的所述纤维素酶和所述果胶酶的配比为(800-4800)U纤维素酶/g根和(10-40)U果胶酶/g根，优选为(800-3200)U纤维素酶/g根。

本发明方法特别适合于蔷薇科植物的白色幼嫩初生根，优选为通过组织培养得到的。

上述蔷薇科植物可以为苹果属、梨属、桃属、杏属、李属或樱属植物；优选为珠美海棠(Malus zumi Mats)和山定子[Malus baccata(L.)Borkh]。