[发明专利]一种利用耐酸性细菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种紫外诱变耐酸性运动发酵单胞菌的方法及利用该菌株开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法。

背景技术

近年来，随着经济的不断发展，化石能源的日益枯竭，对可再生能源的研究日益受到人们重视。燃料乙醇由于其制备工艺简单，并且可以作为乙醇汽油使用，得到了世界各国的广泛关注。近年来，人们对利用微生物发酵生产燃料乙醇的技术进行了广泛研究，公开号为CN1948498的专利公布了一种利用酵母发酵餐厨垃圾生产燃料乙醇的方法，具有原料价格成本低，环境效益重大的优点，但发酵时间需要近60h，周期较长。近年来，运动发酵单胞菌由于其乙醇产率高，发酵速率快，易进行基因改良等优点而日益受到人们的重视。但由于该菌株生长条件不如酵母菌粗犷，而制约了其大规模应用的前景。除却菌株的发展，各种节能低耗的发酵工艺更是不断被研发出来。不灭菌的开放式发酵可以省却灭菌所需的大量能耗，同时可以避免高温灭菌过程中对营养物质的破坏，而日益受到人们重视。控制底物至较酸环境，同时尽量缩短发酵时间是实现开放式发酵的重要条件。若能获得一株在不易孳生杂菌的酸性条件下仍能正常生长且乙醇产率比酵母更高的菌种，则能够省却在生产过程中的灭菌步骤，从而大大降低运行成本，使工艺简单、节能、经济。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用经紫外诱变的耐酸性细菌在开放式条件下发酵餐厨垃圾生产乙醇的方法，无需外加任何营养物质，无需严格的无菌操作条件，易于控制，具有简单、节能、经济的优势。

本发明所述的乙醇生产方法，是采用不灭菌的开放式乙醇发酵方式，即取消现有酶解-乙醇发酵工艺中高温灭菌步骤。

本发明目的通过如下步骤实现：

1)出发菌株运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis 10225的酸性驯化

以中国工业微生物菌种保藏中心的运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis 10225为出发菌株，利用0.05～0.10mol/L的HCl溶液调节液体葡萄糖基础培养基至pH为3.5～4.5，加入琼脂，制成固体培养基，灭菌后待用。将运动发酵单胞菌活化三代后，在已准备好的固体葡萄糖基础培养基中用双层涂布平板法对其进行划线分离，选取生长旺盛的菌株作为出发菌株进行下一轮酸性驯化，出发菌株经过三轮驯化，使得细菌能够在酸性条件下高效生长，选取生长能力强的一株菌，接入液体葡萄糖基础培养基，制成菌株悬液，进行后续的酸性发酵试验。

2)耐酸性菌株的紫外诱变

将驯化后的耐酸菌株接种到液体葡萄糖基础培养基，制成菌株悬液，用无菌水稀释至每毫升10⁶-10⁸个细胞，取稀释液1～3ml置于培养皿中进行紫外照射，照射后，诱变菌液在黑暗冷冻中保存1-2h，然后在红灯下稀释，在固体葡萄糖基础培养基上涂菌进行筛选，培养温度为30-35℃，时间为24-48小时，挑选长势良好的菌株进行乙醇发酵试验，根据诱变株在液体葡萄糖基础培养基中产乙醇的能力，筛选出一株发酵速度最快，产乙醇能力最高且稳定性好的菌株，置于4℃左右的冰箱中保存备用。

紫外照射的紫外灯功率为15-20W，紫外照射距离为20-30cm，照射时间为30～60秒。

3)利用上述耐酸性运动发酵单胞菌开放式发酵餐厨垃圾生产乙醇

将粉碎后的餐厨垃圾与水按1-2∶1的质量比进行混合，用稀盐酸将其pH调节到3.5-4.5，得到餐厨垃圾的发酵培养基，然后按每克餐厨垃圾发酵培养基接入50-150U的糖化酶和蛋白酶，然后将经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌接入液体葡萄糖基础培养基培养24～36h，得到接种液，并按照每100g餐厨垃圾发酵培养基5-10ml运动发酵单胞菌的比例接入经紫外诱变的耐酸性运动发酵单胞菌，在30-35℃的密闭发酵摇瓶中进行不灭菌的厌氧发酵，发酵时间为24-48小时，再经过蒸馏提纯，即获得工业乙醇产品。

葡萄糖基础培养基所含组分及配比为：液体葡萄糖基础培养基为葡萄糖100g，酵母膏5g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁0.5g，硫酸铵1g，水1000ml；固体葡萄糖基础培养基为在上述成分基础上再加入20g的琼脂。

本发明具有如下优点：本发明所选用的生产菌种为经紫外诱变的运动发酵单胞菌，替代了传统乙醇发酵所用的酵母菌，该菌具有产乙醇效率高，产生物量少，产醇速率快，乙醇耐受力强，能够在偏酸性的pH条件下发酵，发酵时无需控制加氧，耐高渗透压，易于基因操作。

本发明无须高温灭菌发酵底物，无需严格的无菌操作条件；发酵过程无须额外添加任何营养物，生产条件温和，能耗低，无污染。