[发明专利]一种乙肝病毒前C-C基因疫苗的制备及应用

权利要求书

1.一种乙肝病毒前C-C基因疫苗，其特征在于，其包括真核细胞表达载体VR1012上插入核苷酸序列的乙肝病毒前C-C基因和自身复制调控元件增强子II。

2.一种构建乙肝病毒前C-C基因疫苗的方法，其步骤如下：首先以血清中的HBV DNA为模板，用套式PCR扩增出乙肝病毒ENH II、前C/C基因，连入T-easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因连入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到乙肝病毒前C-C基因疫苗质粒。

3.一种人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗，其特征在于，其采用单引物二次PCR法对权利要求1或2中的乙肝病毒前C-C基因疫苗重组质粒中的蛋白酶切位点151+154进行点突变。

4.根据权利要求3所述的人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗的构建方法，其步骤如下：首先合成2对引入点突变的引物，以变性的乙肝病毒前C-C基因疫苗质粒质粒DNA为模板，以单条引入突变的寡核苷酸为引物，高保真聚合酶引导DNA合成，经PCR扩增后，再加入另一条互补引物PCR扩增，然后用DpnI酶切除未突变的甲基化模板，转化细菌后克隆筛选得到突变的基因；依次如上法实现151+1542处点突变，形成改造后的突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗。

5.一种人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗，其采用单引物二次PCR法对权利要求1或2中的乙肝病毒前C-C基因疫苗质粒重组质粒中的蛋白酶切位点151+154+164+167进行点突变。

6.根据权利要求5所述的人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗的构建方法，其步骤如下：首先合成4对引入点突变的引物，以变性的乙肝病毒前C-C基因疫苗质粒DNA为模板，以单条引入突变的寡核苷酸为引物，高保真聚合酶引导DNA合成，经PCR扩增后，再加入另一条互补引物PCR扩增，然后用DpnI酶切除未突变的甲基化模板，转化细菌后克隆筛选得到突变的基因；实现151+154+164+1674处点突变，形成改造后的突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗。

7.根据权利要求3-6所述的人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗，其中所述的蛋白酶切位点的点突变，其具体的操作步骤为：以乙肝病毒前C-C基因疫苗质粒为模板，加入5′端引物151正、Pfu酶行第一轮单引物PCR，以上述PCR反应产物为模板，加入3′端引物151反再行第二轮PCR扩增；DpnI酶切第二轮PCR产物，转化入感受态DH5α细菌，卡那霉素LB培养板筛选阳性单菌落，提质粒测序；如上述步骤在突变质粒的基础上再依次实现另外3个核酸位点突变，分别变异151、154质粒，变异151、154、164质粒、变异151、154、164、167质粒。

8、一种如权利要求1-6中任一项所述的疫苗在治疗和预防乙型炎型肝中的应用。