[发明专利]一种乙肝病毒前C-C基因疫苗的制备及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙肝病毒前C(Pre-C)-C基因疫苗及其应用，更涉及一种人工突变型乙肝病毒前C(Pre-C)-C基因疫苗及其应用，属于HBVDNA疫苗的设计制造及免疫效果检测的生物学领域。

背景技术

慢性乙型肝炎严重危害人类健康，目前尚无特效治疗手段。乙肝病毒(HBV)感染人体后发生慢性化的主要原因是被感染者缺乏有效的特异性细胞免疫应答，不能清除体内病毒。由于DNA疫苗在诱导机体特异性细胞免疫方面具有独特优势，已作为针对慢性乙肝具有潜力的免疫治疗手段被广泛研究。目前乙肝DNA疫苗研究的焦点在于如何诱导足够强的特异性细胞免疫，以达到抑制或消灭病毒、治疗乙肝的目的。

选择合适的目的基因和载体体外连接构建重组质粒，是研究治疗型HBV DNA疫苗的关键基础步骤。对所选目的基因的要求是：能够诱导机体产生较强的针对HBV抗原的特异性细胞免疫反应。HBV的基因组是一环状的部分双螺旋结构，长约3.2kb。基因组中已确定的开放读框有4个，分别编码病毒的核壳(C)和包膜(S)蛋白，病毒DNA聚合酶及X蛋白。目前学者们公认，S基因和C基因是HBV DNA疫苗常用的备选基因。而两者相比较而言，S基因疫苗多应用于预防，前C-C基因理论上则可能产生较S基因更好的治疗效果。因为HBcAg(病毒核壳的组成部分P21c)存在于细胞内，是最强的人类T细胞抗原，可以诱导出较强的MHC-I类限制性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。

ENH II是位于乙肝病毒基因组中前C-C区上游约200bp处的增强子，长约200bp，序列高度保守，能够顺式作用增强乙肝病毒蛋白的表达。作用机理可能通过与某些特定细胞因子结合的方式，已鉴定出有转式激活作用的多种细胞因子(C/EBP、AP1、HNF1等)，能够与ENH相互作用参与调节HBVDNA的转录，并表现出肝细胞特异性。

本发明针对DNA疫苗的诸多特性和优点，采用现代分子生物学技术和手段对其进行了进一步的研究和改进。

发明内容

本发明的第一个目的在于公开一种以乙肝病毒前C(Pre-C)-C基因和自身复制调控元件增强子II(ENH II)为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VEC)。

本发明的第二个目的在于公开一种以包含2个点突变(AA151+AA154)的乙肝病毒前C(Pre-C)-C基因和自身复制调控元件增强子II(ENH II)为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VE2)。

本发明的第三个目的在于公开一种以包含4个点突变(AA151+AA154+AA164+AA167)的乙肝病毒前C(Pre-C)-C基因和自身复制调控元件增强子II(ENH II)为目的基因构建的重组HBV DNA疫苗(VE4)

本发明的第四个目的在于提供一种上述重组HBV DNA疫苗用于乙型肝炎的预防和治疗。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种乙肝病毒前C-C基因疫苗(VEC)，其包括插入核苷酸序列的乙肝病毒前C(Pre-C)-C基因和自身复制调控元件增强子II(EHN II)，其序列如序列表中SEQ IDNo.1所示，该目的基因的真核细胞表达载体均为VR1012。

一种构建乙肝病毒前C-C基因疫苗(VEC)的方法，其步骤如下：首先以血清中的HBV DNA为模板，用套式PCR扩增出乙肝病毒ENHII(含cp)、前C/C基因，连入T-easy载体，再通过双酶切及再连接将目的基因插入真核表达载体VR1012，克隆筛选得到构建好的VEC质粒。

一种人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗(VE2)，其采用单引物二次PCR法对乙肝疫苗(VEC)重组质粒中的蛋白酶切位点151+154进行点突变。

一种人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗(VE4)，其采用单引物二次PCR法对乙肝疫苗(VEC)重组质粒中的蛋白酶切位点151+154+164+167进行点突变。

所述的蛋白酶为Furin蛋白酶。

一种构建人工突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗(VE2)的方法，其步骤如下：首先合成2对引入点突变的引物，以VEC质粒DNA为模板，以单条引入突变位点的寡核苷酸为引物，高保真聚合酶引导DNA合成，经PCR扩增后，再加入另一条互补引物PCR扩增，然后用DpnI酶切除未突变的甲基化模板，转化细菌后克隆筛选得到突变的基因；依次如上法实现2处点突变，形成改造后的突变型乙肝病毒前C-C基因疫苗VE2(151+154点突变)表达生成胞内型分子量P22的HBeAg前体蛋白。