[发明专利]从牛奶中提取总DNA的方法

权利要求书

1.一种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤：

1)采样前准备：用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前2-3把奶，之后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样，所用的牛奶样品是加防腐剂后24小时以内的奶样；

2)采样：预先在离心管中加入1ml体细胞固定液和20％的重铬酸钾0.5ml作为防腐剂，将采集的奶样装入离心管至50ml，于2500转/分，4℃离心30分钟；

3)弃去步骤2)离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加1ml灭菌磷酸缓冲液，将底部沉淀吹打悬浮并转移至1.5ml的离心管中，在3500转/分，常温下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀；

4)向步骤3)的离心管中加入灭菌的磷酸缓冲液1ml，悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在1000转/分，常温下离心10分钟；

5)离心后将上清弃去，加乳化剂150μl，再加灭菌的磷酸缓冲液1350μl，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理5-10分钟脱去体细胞周围的乳脂；

6)水浴后，在3500转/分，常温下离心10分钟，离心后弃上清，加磷酸缓冲液1ml悬浮沉淀，将混合液转移至1.5ml的离心管中，于12000转/分离心10分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置-20℃冻存，或者直接将所述的体细胞进行DNA提取；

7)向步骤6)存有体细胞的1.5ml离心管中加入裂解混合液Ⅰ600μl和裂解混合液Ⅱ150μl，振荡使其底部沉淀至完全悬浮，置于56℃水浴锅过夜消化，得到消化产物；

8)对步骤7)的消化产物加入等体积的无水乙醇，12000转/分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别加1ml的95％、75％、70％乙醇进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙醇，在常温下蒸发乙醇5分钟，得到DNA粗品；

9)将步骤8)得到的DNA粗品加500μl去离子灭菌水使其溶解沉淀，再加两倍体积的pH为8.0的Tris饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒10分钟，12000转/分，常温下离心10分钟，得到上清液；

10)将步骤9)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，来回颠倒10分钟，按体积比为25∶24∶1加入两倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇，在12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；

11)将步骤10)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，按体积比为24∶1加入两倍体积氯仿：异戊醇，来回颠倒10分钟，12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；

12)将步骤11)的上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入1/10体积的3M，pH为5.2的NaAc和2倍体积的预冷过的无水乙醇，来回摇晃离心管，于-20℃放置30分钟；再于12000转/分，25℃下离心10分钟，小心倒掉上层无水乙醇，得到DNA白色沉淀；

13)加入70％的乙醇1ml，洗涤步骤12)所述的DNA白色沉淀，于常温下12000转/分离心10分钟，小心弃去乙醇，在常温下挥发残留乙醇，加入的50-100μl三(羟甲基)氨基甲烷-乙二胺四乙酸过夜溶解DNA，得到DNA纯品；

其中，

步骤2)所述的体细胞固定液配制如下：

将按体积计的35-40％的甲醛9.4ml定溶于100ml蒸馏水中，得到体细胞固定液；

步骤5)所述的乳化剂配制如下：

在1L乳化剂中：按重量计的90％的聚乙二醇辛基苯基醚(triton-x 100)20ml，95％乙醇125ml，0.9g/lNaCl溶液855ml；

步骤7)所述的裂解混合液Ⅰ配制如下：

混合液Ⅰ：NaCl 1M，Tris-Cl 0.5M，EDTA-Na 0.5M，调pH至7.5-8.0；

步骤7)所述的裂解混合液Ⅱ配制如下：

按重量计的20％的十二烷基硫酸钠40μl，20mg/ml的蛋白酶K 20μl，乳化剂90μl；

步骤13)所述的Tris-EDTA溶液配制如下：

分别取pH为8.0的1M Tris-Cl 2ml和0.5M EDTA0.4ml，将其两种溶液混合均匀，加蒸馏水定容至200ml，调pH至8.0；

步骤3)、4)、5)和6)所述的磷酸缓冲液配制如下：

分别称取NaCl 8g，KCL 0.2g，Na₂HPO₄1.44g，KH₂PO₄0.24g，将所述的物质溶解于800ml蒸馏水中，调pH至7.4，加蒸馏水定容至1L。