[发明专利]从牛奶中提取总DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及奶牛分子生物学技术领域。具体涉及从牛奶样品中纯化体细胞与抽提总DNA的方法。

背景技术

获得基因组DNA是进行后续分子生物学研究的基础，寻找合适的DNA提取方法是开展大多数分子生物学实验所面临的第一个问题，目前使用无应激方法获得奶牛DNA是研究者面临的一个重要问题，尤其表现在动物福利方面，主要原因是由于采取血样会造成应激反应，降低奶牛生产性能。当前从奶牛个体获得基因组DNA的样本来源主要有：血液、肌肉组织、脏器组织、精液等，这几个样本来源使用常规的提取方法，提取的效果较好。目前利用牛奶作为高质量DNA提取来源，存在技术匮乏问题。当前利用奶样作为来源提取DNA的方法主要有盐析法(田雨，从牛奶中分离DNA方法的建立；乳业科学；2006，3：112-113。F.d’Angelo，A.Santillo，A.Sevi，and M.Albenzio(2007)采用盐析法提取羊奶总DNA(A Simple Salting-Out Methodfor DNA Extraction from Milk Somatic Cells：Investigation into the Goat CSN1S1基因.J.DairySci.90：3550-3552).)和SDS/酚法(E.LIPKIN，ANNE SHALO M，H.KHATIB，M.SOLLER，and A.FRIEDMANN(1993).Milk as a Source of Deoxyribonucleic Acid and as a Substrate for the PolymeraseChain Reaction.J Dairy Sci 76：2025-2032)，都是先得到体细胞，然后再用相应的试剂消化抽提。就目前的技术，得到的奶样DNA在纯度和浓度都相对较低，因此更加需要改进方法，已达到获得较好的奶样DNA样品。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，建立一种从牛奶中抽提总DNA的方法，以达到快速、经济、方便的效果，适用于奶牛分子生物学的技术操作。

本发明通过以下技术方案实现：

一种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤：

1、一种从牛奶中提取总DNA的方法，其特征在于以下步骤：

1)采样前准备：用碘酒擦洗奶牛乳头，用干净温水布擦干乳头上的碘酒，放弃挤出的前2-3把奶，之后用挤奶器或者人工挤奶方法获取奶样；

2)采样：预先在离心管中加入1ml体细胞固定液和20％重铬酸钾0.5ml作为防腐剂，将采取的奶样装入离心管至50ml，于2500转/分，4℃离心30分钟；

3)弃去步骤2)离心管的上层乳脂和中间层乳液，保留其底部沉淀，向底部加1ml灭菌磷酸缓冲液，将底部沉淀捶打悬浮并转移至1.5ml的离心管中，在3500转/分，常温(20-25℃)下离心10分钟，弃去上层液体，保留底部沉淀；

4)向步骤3)的离心管中加入灭菌的磷酸缓冲液1ml，悬浮沉淀，用振荡器振荡直到沉淀完全悬浮为止，然后在1000转/分，常温下离心10分钟；

5)离心后将上清弃去，加乳化剂150μl，再加灭菌的磷酸缓冲液1350μl，用振荡器振荡至沉淀完全悬浮，40℃恒温水浴处理5-10分钟脱去体细胞周围的乳脂；

6)水浴后，在3500转/分，常温下离心10分钟，离心后弃上清，加磷酸缓冲液1ml悬浮沉淀，将混合液转移至1.5ml的离心管中，于12000转/分离心10分钟使体细胞沉淀，将得到的体细胞置-20℃冻存，或者直接将所述的体细胞进行DNA提取；

7)向步骤6)存有体细胞的1.5ml离心管中加入裂解混合液I600μl和裂解混合液II150μl，振荡使其底部沉淀至完全悬浮，置于56℃水浴锅过夜消化，得到消化产物；

8)对步骤7)的消化产物加入等体积的无水乙醇，12000转/分离心沉淀，弃掉上面的乙醇，然后分别加1ml的95％、75％、70％乙醇进行梯度洗涤，分别弃去上层的乙醇，在常温下蒸发乙醇5分钟，得到DNA粗品；

9)将步骤8)得到的DNA粗品加500μl去离子灭菌水使其溶解沉淀，再加两倍体积的pH为8.0的Tris饱和酚溶液进行抽提，来回颠倒10分钟，12000转/分，常温下离心10分钟，得到上清液；

10)将步骤9)的上消液转移到另一个1.5ml离心管中，来回颠倒10分钟，按体积比为25∶24∶1加入两倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇，在12000转/分，抽提10分钟，得到上清液；