[发明专利]一种葡激酶及其表达载体

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地说涉及一种具有溶栓作用的葡激酶及其表达载体。

背景技术

心脑血管疾病严重威胁人类健康，是主要的致死性疾病。血栓的形成是许多心脑血管疾病的诱因，也是造成死亡和病残的主要原因。溶栓疗法是这类疾病的主要治疗手段之一。自80年代以来溶栓治疗已经成为急性心肌梗死的常规疗法。目前临床常用的溶栓类药物包括尿激酶(UK)，链激酶(SK)，重组组织型纤溶酶原激活物(r-tPA)，但在临床的应用中均有其局限性。

天然葡激酶(staphylokinase，SAK)是溶原性金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)合成的一种单链蛋白，由136个氨基酸组成，其中包括45个带电氨基酸残基不含半胱氨酸及糖基，分子量15.5kDa。1948年Lack发现金黄色葡萄球菌培养物血清中有一种蛋白质能溶解人的血栓，进一步的研究发现SAK可以选择性地作用于纤维蛋白原，揭示了葡激酶具有作为良好的溶栓药物的应用前景。

目前，已有许多作为溶血栓药物的葡激酶的专利申请，如《溶血栓药物重组葡激酶》(专利号：ZL00112674.1)，《利用基因工程技术生产葡激酶的方法》(专利号：ZL98102132.8)，《葡激酶基因及其高表达工程菌株》(专利号：ZL97105988.8)，《一种重组葡激酶的制备方法》(专利号：ZL94112105.4)等。以上发明中所述葡激酶序列多从噬菌体基因组中获得。

发明内容

本发明第一目的是提供一种具有高效溶栓作用的葡激酶。

本发明第二目的是提供含有上述葡激酶基因的表达载体。

本发明第三目的是提供上述葡激酶的制备方法。

本发明第四目的是提供上述葡激酶在制备治疗心脑血管疾病药物上的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种葡激酶，是具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列的多肽。

编码上述葡激酶的基因，具有SEQ ID No：2所示的DNA序列。

含有上述葡激酶基因的重组表达载体。

所述的载体是指pBV220、pET17、pET15或pET28等。

含有上述葡激酶基因的宿主菌。

所述的宿主菌是指E.coliBL21、E.coliDH5α、E.coliHB101、E.coliJM109或E.coliJM103等。

上述葡激酶在制备治疗心脑血管疾病药物上的应用。

上述葡激酶在制备治疗溶血栓药物上的应用。

上述葡激酶在制备治疗心肌梗塞药物上的应用。

含有上述葡激酶基因的重组表达载体的构建方法，包括以金黄色葡萄球菌1.1476的DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；然后将PCR扩增产物和质粒载体分别用EcoRI和BamHI进行双酶切，再用T4连接酶将酶切后的上述质粒载体和所得葡激酶基因DNA片段进行连接，获得含有葡激酶基因的载体质粒；再将该载体质粒转化入宿主菌，获得含有本发明葡激酶基因的工程菌株；其中所述的引物为：

P1：5′GGAATTCAAATGTGAAGTTCATTCGACAAAGGA 3′(SEQ ID No：3)

P2：5′CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAAGAAC 3′(SEQ ID No：4)。

上述构建方法中所述的质粒载体是指pBV220、pET17、pET15或pET28等。

上述构建方法中所述的宿主菌是指E.coliBL21、E.coliDH5α、E.coliHB101、E.coliJM109或E.coliJM103等。

下面以质粒载体pBV220、大肠杆菌BL21为例，具体介绍上述含有本发明葡激酶基因的重组表达载体的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)、以金黄色葡萄球菌1.1476(Staphylococcus aureus 1.1476)的总DNA为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为：

P1：5′GGAATTCAAATGTGAAGTTCATTCGACAAAGGA 3′(SEQ ID No：3)

P2：5′CGGGATCCTTATTTCTTTTCTATAAGAAC 3′(SEQ ID No：4)