[发明专利]一种悬浮的杨扇舟蛾胚胎细胞系及其构建方法

权利要求书

1、一种可悬浮的杨扇舟蛾胚胎细胞系Clan I，CGMCC №.2579。

2、一种权利要求1所述可悬浮的杨扇舟蛾胚胎细胞的构建方法，方法步骤如下：

1)将产下90—100小时的杨扇舟蛾受精卵片用次氯酸钠溶液或甲醛溶液浸泡2—30分钟后用无菌水清洗，再将卵粒用乙醇溶液消毒后用生理盐水Ringer’s清洗；

2)将上述步骤处理后的卵粒倒入昆虫细胞培养液中，逐一轻挤压卵粒释放出胚胎；

3)将步骤2)得到的胚胎剪碎成组织块，转入密闭培养瓶中，放入25～28℃无光照的细胞培养箱中培养20～30小时；

4)加入细胞培养液，使胚胎的组织块完全或超半部分浸没在该培养液中，在与步骤3)同样条件下培养；

5)每7—15天更换培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；

6)从培养瓶中吸出半量的细胞培养液，其中含有新增殖出的单个细胞，放入新培养瓶中，并加入等量的新细胞培养液；而原培养瓶中再加入同吸出量同样多新的细胞培养液；将两个培养瓶再放回培养箱中与步骤3)同样条件下培养；得到杨扇舟蛾胚胎第一代传代细胞，细胞系建立成功；

整个过程都是在无菌条件下进行的。

3、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：继续得到杨扇舟蛾胚胎后一代传代细胞的方法步骤如下：周期重复权利要求2所述的步骤5)及步骤6)。

4、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中用5％—20％的次氯酸钠溶液杨扇舟蛾受精卵片2-15分钟，或用0.2％—1％的甲醛溶液浸泡10-30分钟，用次氯酸钠溶液或甲醛溶液浸泡及用乙醇溶液消毒期间均可不断轻轻振荡。

5、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：胚胎剪碎成1-2mm组织块，所述步骤5)中更换培养液的具体方法是：每7—15天吸出半量的培养液，并同时换入半量新的细胞培养液。

6、根据权利要求2所述的方法，其特征在于：其中所述的细胞培养液是昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6.2-6.6之间，其中细胞培养液中的青霉素与链霉素的总含量不超200U/mL；胎牛血清的体积容量占细胞培养液体积容量的5％—15％。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：其中细胞培养液中的青霉素与链霉素的含量分别为0～100U/mL；胎牛血清的体积容量占细胞培养液体积容量的5％～15％。

8、根据权利要求2所述的昆虫细胞的构建方法，其特征在于：其中所述的昆虫细胞培养液选自商品化的昆虫细胞培养液TNM-FH，Grace’s，TC-100，IPL-41，或Ex-Cell 405。

9、根据权利要求2或3所述的昆虫细胞的构建方法，其特征在于：对得到的杨扇舟蛾胚胎后一代传代细胞进行冻存处理，以保存细胞的种资供使用时再复苏。