[发明专利]一种悬浮的杨扇舟蛾胚胎细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术，尤其涉及一种可悬浮的杨扇舟蛾胚胎细胞系及其构建方法。

背景技术

据报道，在1965年第一株昆虫细胞系成功建立后至今，近40年的时间内，已经建立的昆虫细胞系超过500种。它们分别来源于鳞翅目、双翅目、同翅目、膜翅目、直翅目和鞘翅目等170多种昆虫，其中大部分来源于鳞翅目和双翅目昆虫。昆虫细胞系作为研究材料，一直是生理学、发育生物学、细胞生物学、分子生物学和生物化学等科学研究的重要工具，而且昆虫细胞作为杆状病毒表达载体系统的重要组成部分，表达了大量的具有重大经济意义或科学意义的外源蛋白质；同时作为生物反应器，扩增昆虫杆状病毒用作生物杀虫剂，特别是扩增含有外源基因的重组杆状病毒杀虫剂，昆虫细胞也发挥了重要的作用。

大量的来源于鳞翅目昆虫商品化的细胞系已得到人们广泛的应用，比如，来源于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf-21和其克隆株Sf-9，来源于粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的Tn-368和其克隆株Tn-5B1-4(商品名为High Five)等，已经成功的应用于表达和生产重组蛋白。

鳞翅目的细胞系来源于很多组织，包括卵巢、胚胎、血细胞、脂肪体等。然而，值得一提的是，由于昆虫细胞不完全的去分化，有的已经建立的昆虫细胞系仍然保持一定原始组织和器官的特征。来源于不同种类昆虫的细胞系或来源于同一种昆虫不同组织部位的细胞系扩增病毒或重组蛋白的表达能力各有不同。因此建立和筛选新的、更多的杆状病毒敏感细胞系(株)是一项非常有必要而且有理论和实践意义的工作。

然而，到目前为止还没有来自杨扇舟蛾的细胞系的报道。

杨扇舟蛾(Clostera anachorta Fabricius)是一种危害严重的林业害虫，大量的实验证明杨扇舟蛾颗粒体病毒可有效控制这种害虫，且对环境友好。目前，主要是用杨扇舟蛾幼虫来复制生产这种病毒，成本高，产量小。已经在600多种昆虫中发现了杆状病毒(Martignoni and Iwai，1986)，但是，还是有些昆虫病毒因为缺乏相应的昆虫细胞系从而限制了对它们的研究。例如：对颗粒体病毒敏感的细胞系就较少(Winstanley and Crook，1993)。到目前为止，也还没有对杨扇舟蛾颗粒体病毒(ClanGV)敏感的细胞系的报道。

杨扇舟蛾作为一种重要的食叶害虫，其人工饲养技术还没完全解决，所以建立新的细胞系对杨扇舟蛾颗粒体病毒的复制生产和更加高效的杆状病毒表达载体系统的构建都十分有意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种可悬浮的杨扇舟蛾胚胎细胞系，该细胞系名称为Clan I，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2579。

本发明的另一目的在于提供该细胞系的构建方法，方法步骤如下：

1)将产下90—100小时(为了提供范围，改成小时计算。这个时间非常关键，此时胚胎内未分化的细胞多，便于成系，而且胚胎大小便于操作。胚胎太小时不容易解剖，太大时胚胎表面有一层蜡质，在培养液中容易浮起不利细胞增殖。)的杨扇舟蛾受精卵片用次氯酸钠溶液或甲醛溶液浸泡后用无菌水清洗，再将卵粒用乙醇溶液消毒后用生理盐水(如：Ringer’s)清洗；

2)将上述步骤处理后的卵粒倒入昆虫细胞培养液中，逐一挤压卵粒释放出胚胎；

3)将步骤2)得到的胚胎剪碎成组织块，转入密闭培养瓶中，放入25～30℃无光照的细胞培养箱中培养20～30小时；

4)加入细胞培养液，使胚胎的组织块完全或超半部分浸没在该培养液中，在与步骤3)同样条件下培养；

5)每7—15天更换培养液，直至观察到不断扩展并开始增殖的细胞充满了整个培养瓶；

6)从培养瓶中吸出半量的细胞培养液，其中含有新增殖出的单个细胞，放入新培养瓶中，并加入等量的新细胞培养液；而原培养瓶中再加入同吸出量同样多新的细胞培养液；将两个培养瓶再放回培养箱中与步骤3)同样条件下培养；

7)周期重复步骤5)及步骤6)，细胞开始传代，细胞系建立成功；

整个过程都是在无菌条件下进行的。

本发明所使用的细胞培养液是常规采用的昆虫细胞培养液与青霉素、链霉素和胎牛血清的混合物，配成的细胞培养液pH在6.2-6.6之间。昆虫细胞培养液可以是各种商品化的昆虫细胞培养液，如TNM-FH，Grace’s，TC-100，IPL-41，Ex-Cell 405等等。