[发明专利]一种构建膜蛋白cDNA文库的方法及其应用

权利要求书

1.一种构建膜蛋白cDNA文库的方法，包括以下步骤：

A：用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建；

B：cDNA表达文库的构建；

C：cDNA表达文库稳定转染入细胞，获得稳定表达该文库的细胞株；

D：表达该文库的细胞株经荧光筛选，获得膜蛋白特异的cDNA文库；

所述步骤A用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建包括以下步骤：以真核表达载体pcDNA-DEST47为模板，通过PCR扩增获得包含限制性内切酶HindIII与Xho I的酶切位点，多聚组氨酸识别位点，attR重组位点以及自杀基因ccdB的基因片段的阳性克隆，PCR获得的片段经限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切后回收，与同样经过限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切回收的包含有用于引导蛋白穿膜的信号肽Igk的分泌型载体pSecTagB连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性重组子获得用于筛选膜蛋白的真核表达载体pSecTag-attR。

2.如权利要求1所述的构建膜蛋白cDNA文库的方法，其特征在于所述的大肠杆菌为感受态DB3.1。

3.如权利要求1所述的构建膜蛋白cDNA文库的方法，其特征在于所述的膜蛋白cDNA表达文库是由克隆文库与上述pSecTag-attR表达载体经λ噬菌体特异性重组位点attL与attR进行LR重组反应获得。

4.如权利要求1所述的构建膜蛋白cDNA文库的方法，其特征在于所述的稳定表达该文库的细胞株是将该膜蛋白cDNA表达文库经脂质体介导转入哺乳动物细胞，经抗生素筛选获得稳定表达cDNA文库的细胞克隆库，细胞克隆库经抗多聚组氨酸抗体标记，流式分选细胞仪荧光筛选，获得特异性表达膜蛋白的cDNA文库，该文库稳定表达于该细胞。

5.如权利要求1所述的构建膜蛋白cDNA文库的方法，其特征在于所述的膜蛋白cDNA表达文库转入的哺乳动物细胞为COS-1细胞。

6.如权利要求1所述的构建膜蛋白cDNA文库的方法，其特征在于膜蛋白文库的筛选标记为抗多聚组氨酸的荧光抗体。

7.如权利要求1所述的构建膜蛋白cDNA文库的方法，其特征在于膜蛋白文库的筛选的方法为流式细胞筛选技术

8.一种权利要求1所述构建的膜蛋白cDNA文库的应用，其特征在于含有attL重组位点的小鼠肝脏淋巴细胞cDNA克隆文库被转入表达载体，依据权利要求1所述方法，最终成功建立了小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白cDNA表达文库，经RT-PCR与流式细胞术分析鉴定，该文库具有高通量及高特异性。