[发明专利]一种构建膜蛋白cDNA文库的方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种构建构建膜蛋白cDNA文库方法，包括用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建，膜蛋白在哺乳动物细胞COS-1表面的表达及荧光筛选；并将其应用于小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白的特异性高通量筛选。

背景技术

膜蛋白是细胞质膜的重要组成部分，在质膜发挥生物学功能的过程中发挥着至关重要的作用。例如运输蛋白，连接蛋白以及一些酶类分别在细胞的物质运输与交换，细胞骨架的构成与维持以及细胞能量的产生及信号传导中发挥着重要的作用。其中，受体蛋白作为一类功能多样的蛋白，在维持细胞生存发育中必不可少；并且在淋巴细胞发挥生物学功能的过程中有着决定性作用。

淋巴细胞是机体内一群重要的免疫细胞，在机体的免疫防御、免疫稳定与免疫监视中都发挥着重要作用。主要表现在抵抗和清除病原微生物或其它异物，清除损伤或衰老的细胞，维持其生理平衡的功能以及识别和清除体内出现的突变细胞，防止发生肿瘤。淋巴细胞表面膜蛋白受体与炎症损伤触发密切相关，对淋巴细胞表面膜受体的研究与膜蛋白谱的描绘对研究淋巴细胞功能，维持机体的免疫平衡有着重要意义。

目前，对淋巴细胞表面膜蛋白的研究有一定进展，一些新蛋白的发现极大促进了对淋巴细胞功能的研究，然而仍有大量重要功能的膜蛋白未被发现鉴定，一些重要组织(如肝脏)的淋巴细胞表面膜蛋白谱的描绘尚处于空白，其根本原因是尚无大规模高通量特异的筛选膜蛋白质的方法。

目前，对膜蛋白的筛选主要有几种方法。免疫筛选方法是寻找未知膜蛋白的常用方法(Seed B，Aruffo A.Molecular cloning of the CD2 antigen，the T-cell erythrocytereceptor，by a rapid immunoselection procedure.Proc Natl Acad Sci U S A1987；84：3365-3369.)，即利用一种蛋白的已知抗体或配体与该种蛋白的特异的相互作用对该未知蛋白进行检测鉴定。然而，由于需要利用已知的抗体和配体，使该种方案有很大的局限性。近年来，一种信号肽捕获技术被应用到膜蛋白的筛选研究中(Tashiro K，Tada H，Hei lker R，Shirozu M，Nakano T，Honjo T.Signal sequence trap：a cloning strategyfor secreted proteins and type I membrane proteins.Science1993；261：600-603.)，这种技术可以特异的筛选编码信号肽的膜蛋白与分泌蛋白的cDNA，然而大量存在的分泌型蛋白仍然对膜蛋白的研究产生很大的干扰。目前，仍然缺乏一种高通量特异筛选膜蛋白的方法。

发明内容

本发明的目的是建立一种构建膜蛋白cDNA文库方法，并将其应用于小鼠肝脏淋巴细胞膜蛋白的特异性高通量筛选。

技术方案：

本发明构建膜蛋白cDNA文库的方法，包括以下步骤：

A：用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建；

B：cDNA表达文库的构建；

C：cDNA表达文库稳定转染入细胞，获得稳定表达该文库的细胞株；

D：表达该文库的细胞株经荧光筛选，获得膜蛋白特异的cDNA文库。

其中所述的用于筛选膜蛋白的真核表达载体的构建包括以下步骤：以真核表达载体pcDNA-DEST47为模板，通过PCR扩增获得包含限制性内切酶HindIII与Xho I的酶切位点，多聚组氨酸识别位点，attR重组位点以及自杀基因ccdB的基因片段的阳性克隆，PCR获得的片段经限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切后回收，与同样经过限制性内切酶HindIII与Xho I双酶切回收的包含有用于引导蛋白穿膜的信号肽Igk的分泌型载体pSecTagB连接，连接产物转化大肠杆菌，筛选阳性重组子获得用于筛选膜蛋白的真核表达载体pSecTag-attR。

所述的大肠杆菌为感受态DB3.1。

所述的膜蛋白cDNA表达文库是由克隆文库与上述pSecTag-attR表达载体经λ噬菌体特异性重组位点attL与attR进行LR重组反应获得。

所述的稳定表达该文库的细胞株是将该膜蛋白cDNA表达文库经脂质体介导转入哺乳动物细胞，经抗生素筛选获得稳定表达cDNA文库的细胞克隆库，细胞克隆库经抗多聚组氨酸抗体标记，流式分选细胞仪荧光筛选，获得特异性表达膜蛋白的cDNA文库，该文库稳定表达于该细胞。

所述的膜蛋白cDNA表达文库转入的哺乳动物细胞为COS-1细胞。