[发明专利]一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及一种橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法。

背景技术

橡胶树是多年生高大乔木，异花授粉，在遗传上高度杂合，使得橡胶树的育种难度加大。生产上橡胶树种植材料一般有两种，一是实生树，二是芽接树。芽接树个体间产量变异小、产量高、性状一致，但抗逆性较弱。实生树个体间产量变异大、产量低、性状不一致，但抗逆性较强。目前生产上橡胶树种植基本上是用芽接树。橡胶树选育种按照常规育种程序，采用多代自交的办法，时间长且难以得到纯合的植株。

通过橡胶树花药组织培养，诱导胚状体发生、植株再生和进行扩繁，获得自根无性系，为培育橡胶树产量高、抗逆性强而生长快的优良品种，提供了新的技术手段和方法。

采用推广品种花药培养获得的再生植株，起源于花药壁体细胞，具有与母体无性系同样的遗传信息，带有无性繁殖的芽接树的优良性状；同时，它们又是经过脱分化和再分化过程，经过和合子胚十分相似的途径发育，回复到幼态，因而又带有实生树的优良性状。经过多年的橡胶树田间栽培实验表明，花药体细胞植株的表现型与母本植株一致。因此，花药体细胞植株是一种幼态自根无性系，能够集芽接树和实生树的优点于一体，而且不受砧木对接穗的不良影响，能表现出产量高、生长快、抗逆性强、适应性广、经济寿命长等优点，是一种很有发展前途的新一代种植材料，具有广阔的应用前景。

在植物组织培养过程中，培养时间较长时，会出现胚性材料胚性降低、体细胞无性系变异机率增加等问题；而且在实验室中进行较大规模组织培养时，材料较多，管理难度加大。目前，花药培养植株再生频率还不高，一般为1～3％，即100个花药出苗仅1～3株。

至今，橡胶树进行超低温冷冻保存的研究还很少。1997年Enge1mann等研究了胚性愈伤组织的超低温保存，保存后的胚性愈伤组织解冻后可获得体细胞胚，但未能获得再生植株。2007年，法国农业研究国际合作中心(CIRAD)的Lardet等对从橡胶树幼嫩种子内株被来源的愈伤组织成功地进行了液氮超低温冷冻保存，并获得再生植株，但他们采用了程序降温的处理过程。他们使胚性愈伤组织及其环境温度每分钟下降0.2℃，当温度降至-40℃，再投入液氮中保存，操作不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用液氮玻璃化超低温方法保存巴西橡胶树花药愈伤组织方法，该方法可长期保存巴西橡胶树优良材料遗传资源，实现橡胶树优良种质资源长期保存，为生物技术育种提供新途径。

为了实现本发明目的，本发明所述橡胶树花药愈伤组织玻璃化超低温保存方法，包括如下步骤：

1)预培养：将花药愈伤组织接种到预培养基中，暗培养2～3天，培养温度为25～28℃；

2)装载：然后在室温下用60％的PVS₂(玻璃化溶液)处理花药愈伤组织10～30分钟；

3)脱水及冻存：脱水处理后，在0℃下用PVS₂(玻璃化溶液)处理20～40分钟，并去除玻璃化溶液，最后再重新加入玻璃化溶液，于液氮中保存。

本发明所述的花药愈伤组织为胚性愈伤组织，是在橡胶树处于盛花期的春、夏两个花季，选取高产和性状优良的橡胶树的花，选用花粉发育状态为单核期、少数为双核期的花药，在胚性愈伤组织诱导培养基上培养，诱导出胚性愈伤组织。

本发明所述预培养基为改良MS培养基中添加2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)1.0～3.0mg/L、KT(6-糠氨基嘌呤，又名激动素)1.0～3.0mg/L、NAA(萘乙酸)1.0～3.0mg/L、Phytagel(植物凝胶)2.0～3.0g/L、蔗糖50.0～90.0g/L、二甲基亚砜(DMSO)5～10％(体积百分含量)。

本发明中用改良MS培养基是以MS培养基为基本培养基，并将MS培养基中的无水氯化钙、磷酸二氢钾、四水硫酸锰、七水硫酸镁的含量调整为无水氯化钙150～400mg/L、磷酸二氢钾300～450mg/L、四水硫酸锰15～40mg/L、七水硫酸镁400～600mg/L。

所述PVS₂溶液由28～32％的甘油(Gly)、12～18％己二醇(EG)、12～18％的二甲基亚砜(DMSO)和136.9g/L(0.4mol/L)的蔗糖所组成。其中含量为体积百分含量。