[发明专利]一种基于昆虫的囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法

权利要求书

1.一种基于昆虫的囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法，其特征在于： 重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒出芽时带走宿 主细胞膜成分而形成自身的囊膜，将病毒粒子分离出，反复冻融，获得膜蛋 白；所述昆虫为家蚕蛹；

所述的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm的构建方法为：

(1)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；

Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3’；

(2)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物：

Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3’

Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；

(3)以禽流感病毒H5N1HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物：

Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc 3’

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’

(4)以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp-HA融合基因，所用 引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’

(5)以sp-HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp-HA-tm融合 基因，所用引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；

Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；

(6)将融合基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上，转化至感受态细 胞E.coli DH5α中，构建得克隆质粒pGEM-sp-HA-tm；

(7)克隆质粒pGEM-sp-HA-tm经BamH I和Not I双酶切切下sp-HA-tm 融合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8中，构建成重组 转移质粒pBac-sp-HA-tm；

(8)取重组转移质粒pBac-sp-HA-tm DNA和经Bsu36I酶切线性化的修 饰型病毒BmBacPAK6DNA，加入无血清的TC-100培养基混匀，得 pBac-sp-HA-tm转移质粒和BmBacPAK6DNA的混合物；取Dosper加入无血清 的TC-100培养基混均，将事先培养在平皿中的BmN细胞用无血清的TC-100 培养基洗涤两次，并逐滴加入所得的pBac-sp-HA-tm转移质粒和BmBacPAK6 DNA的混合物以及Dosper混合物，27℃培养4-5天，取上清感染平皿中的BmN 细胞，1小时后弃去上清加入等量混合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖，4-5 天后挑取噬斑，感染BmN细胞3-4天，保存上清，细胞用NaOH裂解用于 Southern blot斑点杂交，以sp-HA-tm融合基因作模板用随机引物探针标记 试剂盒标记探针，杂交；取阳性克隆的上清感染家蚕细胞扩增，即得到含 sp-HA-tm融合基因的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm。