[发明专利]一种基于昆虫的囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一 种基于昆虫的囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法。

背景技术

生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细 胞与基质之间的连接等等。参与这些生物功能的主要是膜蛋白，正因如此，膜 蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点，然而，由于膜蛋白本身的疏水性以 及低丰度等特性，使得膜蛋白的研究进展比较缓慢。但是膜蛋白不仅具有非常 重要的生物学功能，也是许多药物的作用靶位点，因而，研究膜蛋白不仅有利 于低丰度蛋白的研究，更为药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然 而，膜蛋白的分离却是膜蛋白研究的“瓶颈”。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明提供一种膜蛋白分离与纯化新的技术方 法。

本发明的一种基于昆虫的囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法：重组杆状 病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒出芽时带走宿主细胞膜成 分而形成自身的囊膜，将病毒粒子分离出，反复冻融，获得膜蛋白。

所述的基于昆虫的囊膜病毒出芽方式制备膜蛋白的方法，包括以下步骤：

(1)重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫细胞后，27℃、5％CO₂培养5～7 天，收获被感染昆虫细胞；

(2)从被感染昆虫细胞中分离纯化出带囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子，经 多步离心后，再进行蔗糖密度剃度离心后收集样品；

(3)脱糖，选择截留分子量为750kD的中空纤维膜，用无菌超纯水置换样 品中的蔗糖，最后得到膜蛋白。

其中步骤(2)中分离纯化出带囊膜的Bm-sp-HA-tm病毒粒子的步骤依次包 括：

(1)取适量被感染昆虫细胞样品，与0.85％生理盐水适量混和，匀浆至浆 液细致均匀；

(2)将匀浆液加入500ml离心管中，配平，3000rpm离心20-60min，取 上清，弃去油脂；

(3)将3000rpm离心上清液倒入新500ml离心管中，配平，6000rpm离心 20-60min，取上清，弃油脂；

(4)6000rpm离心的上清液倒入50ml离心管，配平，12000rpm离心30- 120min，取上清，弃油脂；

(5)12000rpm离心后的上清，在超净台上分装于灭菌的超离管中，平 衡，35000rpm离心30-90min，使病毒粒子沉淀下来；

(6)35000rpm离心后的上清装入灭菌的瓶中，先置于4℃，沉淀用无菌 溶解液重悬，用枪头反复轻轻吹打，使沉淀能充分溶解，得带囊膜的Bm-sp-HA- tm病毒粒子。

所述的昆虫细胞为家蚕蛹。

所述的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm的构建方法：

(1)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；

Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3’；

(2)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物：

Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc3’

Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct3’；

(3)以禽流感病毒H5N1HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物：

Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc3’

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac3’

(4)以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp-HA融合基因，所用引 物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac3’

(5)以sp-HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp-HA-tm融合基 因，所用引物：