[发明专利]利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法

权利要求书

1.一种利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于： 在家蚕杆状病毒提取液中加入含有外源基因的pUC19-P10-GFP重组质粒及蛋白 酶抑制剂，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表达；所述pUC19-P10-GFP重组质粒 的制备方法包括：

(1)以家蚕杆状病毒基因组DNA为模板，PCR扩增P10启动子序列，PCR 所用的两种引物为：

L-1：5’-atgaatcctgccggccgctccgtgtacggg-3’EcoRI位点；

L-2：5’-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3’BamHI位点；

(2)以质粒pEGFP-N1为模板，PCR扩增GFP报告基因序列，PCR所用的两 种引物为：

L-3：5′-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3′；BamHI位点；

L-4：5′-tcgcatgcttacttgtacagctc-3′；PaeI位点；

(3)将P10启动子序列片段和质粒pUC19进行EcoRI、BamHI双酶切，37 ℃反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coli DH5α，得到pUC19-P10载体；

(4)分别对GFP序列和载体pUC19-P10进行BamHI、PaeI双酶切，37℃反 应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coli DH5α， 得到pUC19-P10-GFP重组质粒。

2.根据权利要求1所述的利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方 法，其特征在于所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括：取蚕蛹，接种杆状 病毒，待蚕蛹发病后，冰上匀浆，吸取匀浆液于1.5ml EP管中，-80℃、20℃ 反复冻融3次，4℃，18000rpm离心15-30min，取上清，重复两次后，35000 rpm超速离心30-60min，吸取上清至新的1.5ml EP管中，用500μl管子分装， 每管50μl，即用或存放于液氮中。

3.根据权利要求1所述的利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方 法，其特征在于所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括：接种杆状病毒于家 蚕细胞，待细胞发病后，-80℃、20℃反复冻融3次，4℃，18000rpm离心15-30 min，重复两次后，35000rpm超速离心30-60min，取上清至新的1.5ml EP 管中，用500μl管子分装，每管50μl，即用或存放于液氮中。

4.根据权利要求1所述的利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方 法，其特征在于：所述的蛋白酶抑制剂为PMSF蛋白酶抑制剂。