[发明专利]利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质的合成方法，该方法利用家蚕杆状病毒体外表达系 统合成蛋白质的方法。

背景技术

目前，已广泛利用基因重组技术并使用酵母活细胞、昆虫细胞等表达系统 (以下简称：细胞系统)作为蛋白质的生产方法。但是，活细胞由于其功能保 留而表现出外源蛋白质消失的倾向，并且由于活细胞中细胞毒性蛋白质的表达 阻止了细胞生长而存在许多不能被容易表达的蛋白质。而体外表达系统相对而 言没有上述细胞系统蛋白质合成上的限制，并能在不伤害生物体的情况下合成 蛋白质。另外由于蛋白质的生产不伴有培养等操作，因而与细胞系统相比，可 在短时间内合成蛋白质。此外，由于体外表达系统还用来大规模生产由不被生 物体利用的氨基酸序列组成的蛋白质，因而有望成为有前途的表达方法。

杆状病毒表达系统可使高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键 的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天 然蛋白。在杆状病毒极晚期基因表达过程中，有种高效表达的蛋白，是P10蛋 白：高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白。P10基因现在已被定位和克隆这个基 因的启动子具有较强的启动能力，使外源基因能高水平表达。目前，利用杆状 病毒P10基因启动子进行体外蛋白表达的方法还未有报道。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的一种利用家蚕杆状病毒体外表达系统 合成蛋白质的方法：在家蚕杆状病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重组质粒及 蛋白酶抑制剂，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表达。

所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括：取蚕蛹，接种杆状病毒，待 蚕蛹发病后，冰上匀浆，吸取匀浆液于1.5ml EP管中，-80℃、20℃反复冻 融3次，4℃，18000rpm离心15-30min，取上清，重复两次后，35000rpm 超速离心30-60min，吸取上清至新的1.5ml EP管中，用500ul管子分装， 每管50ul，即用或存放于液氮中。

所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括：接种杆状病毒于家蚕细胞， 待细胞发病后，-80℃、20℃反复冻融3次，4℃，18000rpm离心15-30 min，重复两次后，35000rpm超速离心30-60min，取上清至新的1.5ml EP 管中，用500ul管子分装，每管50ul，即用或存放于液氮中。

所述pUC19-P10-GFP重组质粒的制备方法包括：

(1)以家蚕杆状病毒基因组DNA为模板，PCR扩增P10启动子序列，PCR 所用的两种引物为：

L-1：5’-atgaatcctgccggccgctccgtgtacggg-3’EcoRI位点；

L-2：5’-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3’BamHI位点；

(2)以质粒pEGFP-N1为模板，PCR扩增GFP报告基因序列，PCR所用的 两种引物为：

L-3：5′-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3′；BamHI位点；

L-4：5′-tcgcatgcttacttgtacagctc-3′；PaeI位点；

(3)将P10启动子序列片段和质粒pUC19进行EcoRI、BamHI双酶切，37 ℃反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coli DH5α，得到pUC19-P10载体；

(4)分别对GFP序列和载体pUC19-P10进行BamHI、PaeI双酶切，37℃ 反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coli DH5α，得到pUC19-P10-GFP重组质粒。

所述的蛋白酶抑制剂为PMSF蛋白酶抑制剂。

本发明的有益之处在于：传统的蛋白表达方法有两个途径，一是原核表 达，它具有许多的优点，如表达周期短，成本低，但有些基因在原核系统中的 持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，目的蛋白常以包涵体形式表达，导 致产物纯化困难，且不利于蛋白形成正确的构象；二是真核表达，它能诱导基 因高效表达，且能严格调控基因表达，但它受细胞培养的限制。本发明所述的 方法不受细胞的限制，可在短时间内(3—6小时内)合成蛋白质，以溶解状态 存在，这有利于蛋白的分离纯化，同时它属于真核表达体系，有利于蛋白形成 正确的构象。

附图说明