[发明专利]基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法

权利要求书

1.一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法，其特征在 于：通过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出 芽后，宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白；所述昆 虫为家蚕蛹；

所述重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm的构建方法包括以下步骤：

(1)以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；

Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3’；

(2)以gp64 DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物：

Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc 3’

Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；

(3)以禽流感病毒H5N1 HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物：

Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc 3’

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’

(4)以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp-HA融合基因，所用引 物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac 3’

(5)以sp-HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp-HA-tm融合基 因，所用引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc 3’；

Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct 3’；

(6)将融合基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上，转化至感受态细胞 E.coli DH5α中，构建得克隆质粒pGEM-sp-HA-tm；

(7)克隆质粒pGEM-sp-HA-tm经BamH I和Not I双酶切切下sp-HA-tm 融合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8中，构建成重组转 移质粒pBac-sp-HA-tm；

(8)取重组转移质粒pBac-sp-HA-tm DNA和经Bsu36I酶切线性化的修饰 型病毒BmBacPAK6 DNA，加入无血清的TC-100培养基混匀，取Dosper加入无 血清的TC-100培养基混均，将事先培养在平皿中的BmN细胞用无血清的TC-100 培养基洗涤两次，并逐滴加入pBac-sp-HA-tm转移质粒和Dosper混合物，27 ℃培养4-5天，取上清感染平皿中的BmN细胞，1小时后弃去上清加入等量混 合的TC-100培养基和低熔点琼脂糖，4-5天后挑取噬斑，感染BmN细胞3-4天， 保存上清，细胞用NaOH裂解用于Southern blot斑点杂交，以sp-HA-tm融合 基因作模板用随机引物探针标记试剂盒标记探针，杂交；取阳性克隆的上清感 染家蚕细胞扩增，即得到含sp-HA-tm融合基因的重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm。

2.根据权利要求1所述的基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的 分离方法，其特征依次包括以下步骤：

(1)重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm1×10⁶PFU/条针刺接种法感染昆虫宿主细 胞，培养5-7天，收获细胞；

(2)将上述收获物在4℃下解冻后，与0.85％生理盐水混和，匀浆； 3000rpm离心20-60min，取上清；6000rpm离心20-60min，取上清；12000rpm 离心30-120min，取上清；18000rpm离心30-120min，取上清；35000rpm离心 30-90min；35000rpm离心后，取上清，进行超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋 白。