[发明专利]基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白质工程中的蛋白表达与分离纯化的领域，特别涉及一 种利用昆虫病毒出芽后分离获得细胞膜及细胞器的膜蛋白的方法。

背景技术

生物膜有着重要的生物功能，如提供细胞识别位点，介导细胞与细胞、细 胞与基质之间的连接等等。膜蛋白的研究也正成为蛋白质组研究的热点。膜蛋 白是许多药物的作用靶位点，研究膜蛋白不仅有利于低丰度蛋白的研究，更为 药物研发和疾病的诊断提供靶体与标记蛋白质。然而，膜蛋白的分离是膜蛋白 研究的“瓶颈”。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明提供一种细胞膜和细胞器膜蛋白分离与 纯化新的技术方法。

本发明的一种基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法：通 过重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm感染昆虫宿主细胞后增殖，在病毒大量出芽后， 宿主细胞膜破裂，经分离、超滤，获得细胞膜及细胞器膜蛋白。

所述的基于昆虫病毒出芽后细胞膜及细胞器膜蛋白的分离方法，依次包括 以下步骤：

(1)重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm×10⁶PFU/条针刺接种法感染昆虫宿主细 胞，培养5—7天，收获细胞；

(2)将上述收获物在4℃下解冻后，与0.85％生理盐水混和，匀浆； 3000rpm离心20-60min，取上清；6000rpm离心20-60min，取上清；12000rpm 离心30-120min，取上清；18000rpm离心30-120min，取上清；35000rpm离心 30-90min；35000rpm离心后，取上清，进行超滤，获得细胞膜及细胞器的膜蛋 白。

所述的昆虫宿主细胞为家蚕蛹。

所述重组杆状病毒Bm-sp-HA-tm的构建方法包括以下步骤：

(1)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64信号肽，所用引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；

Psp2：5’catgtgtaacagtaacgttcttttccgcaaaggcagaatgcgccgccgcc 3’；

(2)以gp64DNA为模板，PCR扩增gp64跨膜域，所用引物：

Ptm1：5’gtcgttacaatgcagaatttgcattggtgatactgggctatccaaaaatc3’

Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct3’；

(3)以禽流感病毒H5N1HA基因为模板，PCR扩增HA基因，所用引物：

Pha1：5’gaaaagaacgttactgttacacatgc3’

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac3’

(4)以gp64信号肽和HA基因为模板，PCR扩增sp-HA融合基因，所用引 物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；

Pha2：5’aatgcaaattctgcattgtaacgac3’

(5)以sp-HA融合基因和gp64跨膜域为模板，PCR扩增sp-HA-tm融合基 因，所用引物：

Psp1：5’gcggatcc atgctactagtaaatcagtc3’；

Ptm2：5’gagcggccgc ttactttccaagtcggttcatctct3’；

(6)将融合基因sp-HA-tm连接到pGEM-T vector上，转化至感受态细胞 E.coli DH5α中，构建得克隆质粒pGEM-sp-HA-tm；

(7)克隆质粒pGEM-sp-HA-tm经BamHI和NotI双酶切切下sp-HA-tm融 合基因片段克隆至经BamH I和Not I双酶切的pBacPAK8中，构建成重组转移 质粒pBacsp-HA-tm；