[发明专利]香菇L03、Cr02或沪农1号的分子特异性标记引物及检测方法

权利要求书

1.香菇L03、Cr02或沪农1号菌种的分子特异性标记引物，所述引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′；

下游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

2.一种用权利要求1所述的分子特异性标记引物对香菇L03、Cr02或沪农1号菌种进行鉴定和检测的方法，所述方法为：提取待测香菇菌种基因组DNA作为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、Cr02或沪农1号菌种中的一种；所述

分子特异性标记引物序列为：

上游引物5′-ATCCGAAGCTCTTCAGTAAAC-3′

上游引物5′-TGCCGAAGTATATCAAG-3′。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：

所述PCR反应体系组成如下：

PCR Buffer           终浓度为1×

dNTPs                1mmol/L

MgCl₂                2.5mmol/L

Taq DNA酶            2.5U

上、下游引物         各1.25μM

模板DNA              60ng

余量为ddH₂O；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法如下：

(1)取待测香菇菌种，接种至PDA斜面，25℃培养14d，转接至PD液体培养基中，25℃下振荡培养14d，收集菌丝，以SDS-CTAB法提取待测香菇菌种基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增：

PCR反应体系每20μL组成如下：

10×PCR Buffer            2μL

10mmol/L dNTPs            2μL

25mmol/L MgCl₂            2μL

5U/μL Taq DNA酶          0.5μL

25μM上、下游引物         各1μL

20ng/μL模板DNA           3μL

ddH₂O补足至20μL；

PCR反应条件如下：

94℃预变性6min后；92℃变性40s，52℃退火40s，72℃延伸2min，共30个循环；最后于72℃补平7min，终止温度为4℃；

(3)取步骤(2)扩增产物5μL，与1μL 0.25％溴酚兰缓冲液混匀，点样于1.5％的琼脂糖凝胶上，于1×TAB缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后用EB染色，于自动凝胶图像分析仪上照相，若电泳结果出现493bp的DNA条带，则待测菌种为香菇L03、Cr02或沪农1号菌种中的一种。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述EB染色为在含0.5μg/ml EB的水溶液中染色30分钟。